Как сделать мазок мокроты
Микроскопический анализ мокроты
Медицинский эксперт статьи
Микроскопическое исследование нативных и фиксированных окрашенных препаратов мокроты позволяет подробно изучить ее клеточный состав, и известной степени отражающий характер патологического процесса в легких и бронхах, его активность, выявить различные волокнистые и кристаллические образования, также имеющие важное диагностическое значение, и, наконец, ориентировочно оценить состояние микробной флоры дыхательных путей (бактериоскопия).
При микроскопии используют нативные и окрашенные препараты мокроты. Для изучения микробной флоры (бактериоскопии) мазки мокроты обычно окрашивают по Романовскому-Гимзе, по Граму, а для выявления микобактерий туберкулеза но Цилю-Нильсену.
Клеточные элементы и эластические волокна
Из клеточных элементов, которые можно обнаружить в мокроте больных пневмонией, диагностическое значение имеют эпителиальные клетки, альвеолярные макрофаги, лейкоциты и эритроциты.
Эпителиальные клетки. Плоский эпителий из полости рта, носоглотки, голосовых складок и надгортанника диагностического значения не имеет, хотя обнаружение большого количества клеток плоского эпителия, как правило, свидетельствует о низком качестве образца мокроты, доставленного в лабораторию и содержащего значительную примесь слюны.
У больных пневмониями мокрота считается пригодной к исследованию, если при микроскопии с малым увеличением количество эпителиальных клеток не превышает 10 в поле зрения. Большее количество эпителиальных клеток указывает на недопустимое преобладание в биологическом образце содержимого ротоглотки.
Альвеолярные макрофаги, которые в незначительном количестве также можно обнаружить в любой мокроте, представляют собой крупные клетки ретикулогистиоцитарного происхождения с эксцентрически расположенным крупным ядром и обильными включениями в цитоплазме. Эти включения могут состоять из поглощенных макрофагами мельчайших частиц пыли (пылевые клетки), лейкоцитов и т.п. Количество альвеолярных макрофагов увеличивается при воспалительных процессах в легочной паренхиме и дыхательных путях, в том числе при пневмониях.
Клетки цилиндрического мерцательного эпителия выстилают слизистую оболочку гортани, трахеи и бронхов. Они имеют вид удлиненных клеток, расширенных с одного конца, где расположено ядро и реснички. Клетки цилиндрического мерцательного эпителия обнаруживаются в любой мокроте, однако их увеличение свидетельствует о повреждении слизистой бронхов и трахеи (острый и хронический бронхит, бронхоэктазы, трахеит, ларингит).
Лейкоциты в небольшом количестве (2-5 в поле зрения) обнаруживаются в любой мокроте. При воспалении ткани легкого или слизистой бронхов и трахеи, особенно при нагноительных процессах (гангрена, абсцесс легкого, бронхоэктазы) их количество значительно увеличивается.
При окраске препаратов мокроты по Романовскому-Гимзе удается дифференцировать отдельные лейкоциты, что имеет иногда важное диагностическое значение. Так, при выраженном воспалении легочной ткани или слизистой бронхов увеличивается как общее число нейтрофильных лейкоцитов, так и количество их дегенеративных форм с фрагментацией ядер и разрушением цитоплазмы.
Увеличение числа дегенеративных форм лейкоцитов является важнейшим признаком активности воспалительного процесса и более тяжелого течения заболевания.
Эритроциты. Единичные эритроциты можно обнаружить практически и любой мокроте. Значительное их увеличение наблюдается при нарушении сосудистой проницаемости у больных пневмониями, при разрушении ткани легкого или бронхов, застое в малом круге кровообращения, инфаркте легкого и т.д. В большом количестве эритроциты в мокроте обнаруживаются при кровохарканье любого генеза.
Нередко при крупозной пневмонии, туберкулезе, актиномикозе, фибринозном бронхите в препаратах мокроты можно обнаружить тонкие волокна фибрина.
Признаками активного воспалительного процесса в легких являются:
Появление в мокроте эластических волокон свидетельствует о деструкции легочной ткани и формировании абсцесса легкого.
Окончательные выводы о наличии и степени активности воспаления и деструкции легочной ткани формируются только при их сопоставлении с клинической картиной заболевания и результатами других лабораторных и инструментальных методов исследования.
[1], [2], [3], [4], [5], [6]
Микробная флора
Микроскопия мазков мокроты, окрашенных по Граму, и изучение микробной флоры (бактериоскопия) у части больных пневмонией позволяет ориентировочно установить наиболее вероятного возбудителя легочной инфекции. Этот простой метод экспресс-диагностики возбудителя недостаточно точен и должен использоваться только в комплексе с другими (микробиологическими, иммунологическими) методами исследования мокроты. Иммерсионная микроскопия окрашенных мазков мокроты иногда бывает весьма полезной для экстренного подбора и назначения адекватной антибактериальной терапии. Правда, следует иметь в виду возможность обсеменения бронхиального содержимого микрофлорой верхних дыхательных путей и ротовой полости, особенно при неправильном сборе мокроты.
Поэтому мокроту считают пригодной для дальнейшего исследования (бактериоскопии и микробиологического исследования) только в том случае, если она удовлетворяет следующим условиям:
Бактериальные возбудители пневмоний
Предварительная бактериоскопия мокроты является наиболее простым способом верификации возбудителя пневмонии и имеет определенное значение для выбора оптимальной терапии антибиотиками. Например, при обнаружении в мазках, окрашенных по Грамму, громположительных диплококков (пневмококков) или стафилококков вместо антибиотиков широкого спектра действия, увеличивающих риск селекции и распространения аитибиотикорезистентных микроорганизмов, возможно назначение целенаправленной терапии, активной в отношении пневмококков или стафилококков. В других случаях выявление преобладающей в мазках грамотрицательной флоры может указывать па то, что возбудителем пневмонии являются грамотрицательные энтеробактерии (клебсиелла, кишечная палочка и т.п.), что требует назначения соответствующей целенаправленной терапии.
Следует также помнить, что «атипичные» внутриклеточные возбудители (микоплазма, легионелла, хламидии, риккетсии) не окрашиваются по Грамму. В этих случаях подозрение на наличие «атипичной» инфекции может возникнуть, если в мазках мокроты обнаруживают диссоциацию между большим количеством нейтрофилов и чрезвычайно малым количеством микробных клеток.
К сожалению, метод бактериоскопии и целом отличается достаточно низкой чувствительностью и специфичностью. Hе предсказательная ценность даже в отношении хорошо визуализируемых пневмококков едва достигает 50%. Это означает, что в половине случаев метод дает ложноположительные результаты. Это связано с несколькими причинами, одной из которых является то, что около 1/3 больных до госпитализации уже получали антибиотики, что существенно снижает результативность бактериоскопии мокроты. Кроме того, даже в случае положительных результатов исследования, указывающих на достаточно высокую концентрацию в мазке «типичных» бактериальных возбудителей (например, пневмококков), нельзя полностью исключить наличие ко-инфекции «атипичными» внутриклеточными возбудителями (микоплазмой, хламидиями, легионеллой).
Метод бактериоскопии мазков мокроты, окрашенных по Грамму, в отдельных случаях помогает верифицировать возбудителя пневмонии, хотя в целом отличается весьма низкой предсказательной ценностью. «Атипичные» внутриклеточные возбудители (микоплазма, легионелла, хламидии, риккетсии) вообще не верифицируются методом бактериоскопии, так как не окрашиваются по Грамму.
Следует упомянуть о возможности микроскопической диагностики у больных пневмониями грибкового поражения легких. Наиболее актуальным для больных, получающих длительное лечение антибиотиками широкого спектра действия, является обнаружение при микроскопии нативных или окрашенных препаратов мокроты Candida albicans в виде дрожжеподобных клеток и ветвистого мицелия. Они свидетельствуют об изменении микрофлоры трахеобронхиального содержимого, возникающем под влиянием лечения антибиотиками, что требует существенной коррекции терапии.
Для повышения эффективности микроскопического выявления микобактерий туберкулеза используют ряд дополнительных методов. Наиболее распространенным из них является так называемый метод флотации, при котором гомогенизированную мокроту взбалтывают с толуолом, ксилолом или бензином, капли которых, всплывая, захватывают микобактерии. После отстаивания мокроты верхний слой пипеткой наносят на предметное стекло. Затем препарат фиксируют и окрашивают по Цилю-Нильсену. Существуют и другие методы накопления (электрофорез) и микроскопии бактерий туберкулеза (люминесцентная микроскопия).
Мицелий и почкующиеся клетки грибов появляются при грибковых поражениях бронхолёгочной системы.
Пневмоцисты появляются при пневмоцистной пневмонии.
Сферулы грибов выявляют при кокцидиоидомикозе лёгких.
Личинки аскарид выявляют при аскаридозе.
Личинки кишечной угрицы выявляются при стронгилоидозе.
Яйца лёгочной двуустки выявляются при парагонимозе.
Элементы, обнаруживаемые в мокроте при бронхиальной астме. При бронхиальной астме обычно отделяется малое количество слизистой, вязкой мокроты. Макроскопически можно увидеть спирали Куршмана. При микроскопическом исследовании характерно наличие эозинофилов, цилиндрического эпителия, встречаются кристаллы Шарко-Лейдена.
Анализ мокроты – как сдать секрет из бронхов для исследования
Мокрота – это слизь, которая образуется в бронхах и трахее при заболеваниях дыхательных путей. Анализ этого секрета выявляет возбудителя, определяет его чувствительность к лекарственным препаратам. Кроме того, исследования показывают стадию болезни, динамику лечения пациента.
Как подготовиться к анализу
Анализ на мокроту лучше сдавать утром, так как ночью во время сна она скапливается в органах дыхательной системы. Приготовьте заранее специальную емкость – стерильную баночку для анализов. Ее крышка должна быть широкой (не менее 35 мм в диаметре), плотно закрываться на внутреннюю резьбу.
После пробуждения почистите зубы, прополощите ротовую полость слабым антисептическим раствором (фурацилина, ромашки). Через полчаса снова выполните полоскание чистой водой, начинайте процедуру. Помните, перед тем, как сдавать мокроту, нельзя завтракать, пить чай, кофе, сок.
Как собрать мокроту
Общий анализ назначается при кашле, который трудно поддается лечению. Чтобы собрать нужное количество мокроты, сядьте на стул, сделайте два глубоких вздоха. На третий раз задержите воздух в легких, а после – резко выдохните.
Глубокое дыхание раздражает кашлевые рецепторы. Поэтому приложите баночку к нижней губе и тщательно откашляйтесь. Повторите процедуру несколько раз, пока в емкости не окажется 3-5 мл мокроты. Во время кашля примите наиболее удобную позу (наклонитесь вперед, лягте на бок, присядьте на корточки).
Если не удается откашлять достаточное количество секрета, можно сделать теплые ингаляции небулайзером. При этом заправляйте резервуар чистой кипяченой водой или физраствором.
Дети и лежачие больные не могут сдать анализ классическим способом. В этом случае помощник проводит тампоном в зоне корня их языка, вызывая кашлевой рефлекс. Влажным от мокроты ватным шариком он проводит по специальным стеклам. А после высушивания – направляет их в лабораторию для исследования.
Особенности сдачи анализа при различных заболеваниях
Врачи назначают анализ на атипичные клетки при подозрении на злокачественную опухоль в органах дыхательной системы. Пациенты сдают мокроту непосредственно в лаборатории, чтобы специалист как можно быстрее приступил к исследованию. Помните, через 2 часа после откашливания клеточные элементы слизи будут полностью разрушены микробной флорой.
Анализ на бактериологическое исследование назначают до приема антибиотиков. Мокроту помещают в культурную среду и создают благоприятные условия для роста бактерий. Через несколько дней врачи приступают к изучению колоний, определению возбудителя, его чувствительности к лекарственному препарату.
Анализ на туберкулез назначают при:
Больной сдает мокроту три раза (утром, вечером, утром следующего дня). Мазки осматривают под микроскопом для выявления микобактерий туберкулеза, оставляют в культурной среде на 2-2,5 месяца. Все это время проводится лечение больного. Но после результатов анализа фтизиатр может скорректировать терапию, подобрать наиболее эффективный лекарственный препарат.
Исследование мокроты методом бронхоскопии
Эта диагностическая процедура проводится для исследования дыхательных путей при подозрении на пневмонию, туберкулез, абсцессах в легких. С ее помощью можно взять анализ мокроты без примесей слюны и слизи из носовых пазух.
Исследование выполняется под местным или общим наркозом. В ходе процедуры бронхоскоп вводится в легкие через ротовую полость. Под контролем изображения с видеокамеры врач проводит забор плохо отделяемой слизи.
Из-за травматичности метода он противопоказан во время острой фазы болезни, а также для людей с легочной и сердечной недостаточностью.
37 лет опыта
Врач-пульмонолог высшей категории. Занимается диагностикой и лечением патологий дыхательных путей. Принимает пациентов с хроническим бронхитом, пневмонией, бронхиальной астмой, профессиональными заболеваниями органов дыхания.
Техника приготовления мазка
Для работы необходимо иметь чистые и обезжиренные предметные и покровные стекла. Новые стекла кипятят 15-20 мин в 2-5% растворе соды или мыльной воде, споласкивают водой и помещают в слабую хлороводородную кислоту, затем тщательно промывают водой.
Стекла, бывшие в употреблении и загрязненные красителями или иммерсионным маслом, можно обработать двумя способами: 1) погрузить на 2 ч в концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, а затем тщательно промыть; 2) кипятить 30-40 мин в 5% растворе соды или щелочи. Необработанные стекла можно обезжирить, натерев их мылом, а затем очистить от него сухой тканью.
Внимание! Если стекло хорошо обезжирено, то капля воды растекается на нем равномерно, не распадаясь на мелкие капли.
Хранят стекла в сосудах с притертыми пробками в смеси Никифорова (равные объемы спирта и эфира) или в 96% спирте. Из растворов стекла извлекают пинцетом.
Внимание! При работе стекла держат пальцами за грани.
Материал для исследования наносят на предметное стекло бактериальной петлей, иглой или пастеровской пипеткой. Чаще всего применяют бактериальную петлю (рис. 7), сделанную из платиновой или нихромовой нити длиной 5-6 см. Петлю закрепляют в петледержателе или впаивают в стеклянную палочку. Конец проволоки сгибают в виде кольца размером 1×1,5 или 2×3 мкм.
Внимание! Правильно приготовленная петля при погружении в воду и извлечении оттуда сохраняет водную пленку.
Перед приготовлением мазка рабочую часть петли прожигают в пламени горелки в вертикальном положении: сначала саму петлю, а затем металлический стержень. Эту манипуляцию проводят и после окончания посева.
Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой питательной среде. Обезжиренное предметное стекло прожигают в пламени горелки и охлаждают. На предметное стекло, помещенное на подставку (чашку Петри, штатив), наносят культуру. Пробирку с культурой держат большим и указательным пальцами левой руки. Петлю держат в правой руке. Не выпуская петли, мизинцем правой руки прижимают пробку к ладони и осторожно вынимают ее из пробирки. Движения должны быть плавными и спокойными. Горло пробирки обжигают в пламени горелки. Вводят петлю в пробирку. Охлаждают петлю о стенку пробирки и затем погружают ее в культуру. Вынимают петлю, не касаясь ею стенок пробирки. Закрывают пробку, предварительно проведя ее через пламя горелки. Ставят пробирку в штатив. Петлей наносят культуру на предметное стекло, круговыми движениями равномерно распределяя ее. Затем петлю прожигают в пламени горелки. Мазок оставляют для высыхания.
Внимание! Мазок должен быть равномерно растертым, тонким и небольшим (с двухкопеечную монету).
Приготовление мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде. На подготовленное предметное стекло наносят пастеровской пипеткой или петлей каплю изотонического раствора натрия хлорида (0,9%). Культуру осторожно снимают петлей с агара в пробирке или чашке Петри и эмульгируют в капле на стекле. Приготовленный мазок должен быть равномерным и не густым. При его высыхании на предметном стекле остается слабый налет.
Приготовление мазка из гноя или мокроты. Материал забирают стерильной пипеткой или петлей и наносят на середину предметного стекла. Вторым предметным стеклом покрывают первое так, чтобы свободными остались треть первого и второго стекол. Стекла с усилием раздвигают в стороны. Получают два больших мазка.
Приготовление мазка из крови. Каплю крови наносят на предметное стекло на расстоянии одной трети от левого края. Затем краем специально отшлифованного стекла, наклонив его под углом 45°, прикасаются к капле крови. Прижимая отшлифованное стекло к предметному продвигают его вперед. Правильно приготовленный мазок имеет желтоватый цвет и просвечивает.
Высушивание мазка
Мазок высушивают на воздухе при комнатной температуре. В случае необходимости его можно высушить около пламени горелки, держа стекло в горизонтальном положении за края большим и указательным пальцами мазком вверх.
Внимание! При высокой температуре может произойти нарушение структуры клеток.
Фиксация мазка
Мазки фиксируют после полного высыхания с целью: 1) закрепить микроорганизмы на стекле; 2) обезвредить материал; 3) убитые микроорганизмы лучше воспринимают окраску. Фиксированный мазок называется препаратом.
Окраска препаратов
После фиксации приступают к окраске препарата.
Окраску препаратов производят на специально оборудованном столе, покрытом линолеумом, пластиком, стеклом и т. д. На столе необходимы сосуд с дистиллированной водой; подставка из двух трубочек или палочек, соединенных резиновыми трубками с обеих сторон (для размещения препаратов); пинцеты, цилиндры, пипетки, фильтровальная бумага, набор красителей, емкость для их слива. Стол для окраски должен находиться рядом с водопроводным краном.
Отношение микроорганизмов к красителям называется их тинкториальными свойствами. В микробиологии широко используют анилиновые красители. Большинство микроорганизмов лучше воспринимает основные красители.
Наиболее употребительны следующие красители: красные (фуксин основной, фуксин кислый, конго красный, нейтральный красный); синие (метиленовый и толуидиновый); фиолетовые (генциановый, метиловый, кристаллический); коричнево-желтые (везувин, хризоидин); зеленые (бриллиантовый, малахитовый).
Все красители выпускают в виде аморфных или кристаллических порошков. Из них готовят насыщенные спиртовые и феноловые растворы, а затем для работы используют водно-спиртовые или водно-феноловые растворы красителей. Если при окраске используют концентрированные растворы красителей, то препарат предварительно накрывают фильтровальной бумагой, на которую наносят краситель. При этом кусочки красителя остаются на бумаге.
Внимание! Каплю красителя наносят пипеткой так, чтобы он покрыл весь препарат.
Рецепты красителей
1. Насыщенные спиртовые растворы (исходные):
Смесь помещают в термостат до полного растворения на несколько дней. Взбалтывают ежедневно. Хранят в склянках с притертыми пробками.
2. Карболовый фуксин Циля (для окраски кислотоустойчивых микроорганизмов, спор и капсул):
Внимание! Карболовую кислоту вливают в краситель, а не наоборот.
Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают, фильтруют и сливают во флакон для хранения.
3. Фуксин Пфейффера (для окраски по Граму и для простого метода окраски):
Краситель готовят непосредственно перед применением.
4. Карболовый генциановый фиолетовый (для окраски по Граму):
насыщенного спиртового раствора
Растворы смешивают и фильтруют через бумажный фильтр.
5. Раствор Люголя (для окраски по Граму и реактив на крахмал):
Смесь помещают в бутыль матового стекла, хорошо закупоривают и ставят на сутки в термостат, затем добавляют 300 мл дистиллированной воды.
6. Щелочной раствор метиленового синего Леффлера:
7. Бумажки по Синеву (для окраски по Граму):
1% спиртовой раствор кристаллического фиолетового
Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором и высушивают.
Методы окраски делят на ориентировочные (простые) и дифференциальные (сложные), выявляющие химические и структурные особенности бактериальной клетки.
Простой метод окраски
На окрашенный и высушенный препарат наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют с помощью иммерсионной системы.
Сложные методы окраски
Окраска по Граму (универсальный метод). Наиболее распространенным методом дифференциальной окраски является окраска по Граму.
Грамположительные бактерии содержат в клеточной стенке магниевую соль РНК, которая образует комплексное соединение с йодом и основным красителем (генциановым, метиловым или кристаллическим фиолетовым). Этот комплекс не разрушается при действии спирта, и бактерии сохраняют фиолетовый цвет.
Грамотрицательные бактерии не способны удержать основной краситель, так как не содержат магниевой соли РНК. Под действием спирта краситель вымывается, клетки обесцвечиваются и окрашиваются дополнительным красителем (фуксином) в красный цвет.
1. На препарат накладывают бумажку по Синеву и наносят несколько капель воды или раствор генцианового фиолетового. Окрашивают 1-2 мин. Снимают бумагу или сливают краситель.
2. Не промывая водой, наносят раствор Люголя до почернения (1 мин), затем краситель сливают.
3. Не промывая водой, наносят 96% спирт до отхождения красителя (30-60 с). Можно опустить препарат в стаканчик со спиртом на 1-2 с.
4. Промывают препарат водой.
5. Докрашивают фуксином Пфейффера 3 мин, промывают водой и высушивают.
Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.
1. Фиксированный препарат покрывают фильтровальной бумагой и наносят фуксин Циля. Удерживая стекло пинцетом, препарат подогревают над пламенем горелки до отхождения паров. Добавляют новую порцию красителя и подогревают еще 2 раза. После охлаждения снимают бумагу и промывают препарат водой.
2. Препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты, погружая 2-3 раза в раствор или наливая кислоту на стекло, затем несколько раз промывают водой.
3. Окрашивают водно-спиртовым раствором метиленового синего в течение 3-5 мин, промывают водой и высушивают.
Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.
Окраска по Ожешко (выявление спор). 1. На высушенный на воздухе мазок наливают несколько капель 0,5% раствора хлороводородной кислоты и подогревают до образования паров. Препарат высушивают и фиксируют над пламенем.
1. На предметное стекло наносят каплю черной туши, разведенной в 10 раз. В нее вносят каплю культуры. Ребром шлифовального стекла делают мазок, так же как мазок крови, и высушивают.
2. Фиксируют химическим способом спиртом или сулемой. Осторожно промывают водой.
3. Окрашивают фуксином Пфейффера 3-5 мин. Осторожно промывают и высушивают на воздухе.
Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить препарат.