какие клеточные структуры содержат днк кольцевой формы субъединицы рибосом хромосомы ядер
Знакомые незнакомцы: внехромосомные кольцевые ДНК
Знакомые незнакомцы: внехромосомные кольцевые ДНК
3D-модель внехромосомной кольцевой ДНК
Автор
Редактор
В истории молекулярной биологии многие открытия сначала опережают время, а потом долгие годы остаются незаслуженно забытыми, пока накопившиеся в области геномики и других «-омик» данные не приведут к их повторному «переоткрытию». Так случилось и с внехромосомной кольцевой ДНК, которая описана у большинства эукариот, а у человека известна с 60-х годов прошлого века. В последнее время этот ранее неизученный пул нуклеиновых кислот привлек внимание ученых, поскольку выяснилось, насколько весомым является их вклад в патогенез онкологических заболеваний. Позволит ли внехромосомная кольцевая ДНК собрать опухолевый пазл в единую картину? Только ли для опухолей характерно ее присутствие? О некоторых аспектах биологии внехромосомных кольцевых ДНК мы и поговорим в этом обзоре.
Рисунок 1. Цитогенетический препарат клетки нейробластомы с присутствующими на нем 16-ю двойными минихромосомами. Опубликовано в журнале Lancet, 1965 год.
Кольцевые ДНК описаны у вирусов, прокариот, низших эукариот (дрожжей, простейших и грибов), а также у некоторых высших растений. У млекопитающих, в том числе у человека, кольцевые ДНК присутствуют в составе митохондриального генома. Весь остальной геном, как считалось, в норме представлен линейными хромосомами и только в опухолях были описаны крупные внехромосомные кольцевые ДНК, которые удавалось наблюдать, изучая образцы новообразований в световом микроскопе (рис. 1).
Эти структуры получили название double minutes (от лат. minutus — маленький, мелкий) — двойные минихромосомы [1]. От обычных хромосом они отличаются не только кольцевой формой и размером, но и тем, что не имеют центромеры.
Впоследствии предложили методы, позволяющие отделить пул кольцевых ДНК от основной массы ДНК с помощью центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия или специфических экзонуклеаз и двумерного гель-электрофореза. Но, как и в случае с кольцевыми РНК (о которых «Биомолекула» писала в [2]), только в последнее время, с развитием технологии секвенирования нового поколения и разработкой биоинформатических подходов для поиска кольцевых молекул, удалось изучить всё их многообразие, ограничивающееся далеко не только двойными минихромосомами.
Четкой номенклатуры внехромосомных кольцевых ДНК, или вкДНК (extrachromosomal circular DNA, eccDNA), пока нет, но сегодня известно о существовании их вариантов размерами от сотен пар нуклеотидов (например, микроДНК, состоящей из 200–400 п.н.) до нескольких миллионов. Внехромосомная кольцевая ДНК может содержать повторяющиеся участки (как, скажем, теломерная или рибосомная ДНК) или состоять из уникальных, неповторяющихся последовательностей. Кольцевая ДНК упакована не столь плотно, как в хромосомах, что играет важную регуляторную роль, так как облегчает доступ к хроматину и способствует транскрипции определенных генов [3].
Точное число всех внехромосомных кольцевых ДНК, присутствующих в клетках, подсчитать достаточно сложно: методы секвенирования для количественного учета не годятся, а флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), позволяющая локализовать в клетках любые последовательности ДНК, характеризуется высоким уровнем «шума». Малый размер и отсутствие четких морфологических «опознавательных знаков» вкДНК еще более затрудняют их идентификацию при FISH.
Совсем недавно на базе нейронной сети U-Net, широко применяющейся при анализе и обработке биомедицинских изображений, была создана программа ecSeg, позволяющая подсчитывать количество внехромосомных кольцевых ДНК в образцах различных клеточных линий [4]. Программа работает с изображениями, получаемыми камерой флуоресцентного микроскопа с метафазных пластинок, окрашенных DAPI (ДНК-связывающимся флуорофором). Проанализировав сорок различных опухолевых клеточных линий человека, создатели программы обнаружили, что некоторые из них (например, клеточная линия рака молочной железы HCC1569) содержат более 100 различных внехромосомных кольцевых ДНК в каждой клетке. Причем вариабельность вкДНК внутри одной и той же клеточной линии обеспечивается уже при их содержании в каждой клетке в количестве всего 10 единиц (и более). Это говорит о той важной роли, которую играет количество вкДНК в повышении неоднородности клеточной популяции.
Умножай и властвуй
Но вернемся к самым известным представителям внехромосомных кольцевых ДНК — двойным минихромосомам. Предполагается, что их появлению в клетке предшествует амплификация (многократное увеличение числа копий) определенных генов. В дальнейшем амплифицированные участки «вырезаются» из хромосомы и закольцовываются. Так, двойные минихромосомы клеток нейробластом (злокачественных опухолей симпатической нервной системы) содержат амплифицированный ген MYCN. Экстрахромосомная амплификация KRAS наблюдается в аденокарциномах пищевода, пищеводно-желудочного перехода и желудка, а также в некоторых случаях колоректального рака. Внехромосомная амплификация гена циклина D1 описана при раке мочевого пузыря [5]. Как правило, каждая кольцевая минихромосома состоит из амплифицированных копий только одного онкогена, хотя есть и исключения: так, описаны внехромосомные кольцевые ДНК с одновременной амплификацией генов EGFR и CDK4 [6]. Средний размер ампликона (участка ДНК, являющегося результатом амплификации) составляет 1,26 миллиона пар нуклеотидов [3], поэтому неудивительно, что двойные минихромосомы достаточно крупны (хоть это и звучит как каламбур).
В дальнейшем кольцевые структуры, несущие амплифицированный онкоген, могут встраиваться в хромосому, причем в произвольно выбранной позиции. В этом случае они формируют на хромосоме гомогенно окрашенные участки (ГОУ; в англоязычной литературе — homogenous staining regions, HSR), представляющие собой цитогенетическое проявление амплификации (рис. 2).
Рисунок 2. Двойные минихромосомы могут приводить к появлению ГОУ при встраивании в один и тот же участок на хромосоме или распределяться случайным образом, встраиваясь в разные участки разных хромосом
Отсутствие центромер приводит к тому, что в процессе митоза двойные минихромосомы, в отличие от обычной хромосомной ДНК, распределяются между дочерними клетками случайным образом. Поскольку амплификация онкогенов придает опухолевой клетке преимущество в скорости роста по сравнению с соседями, те из них, что содержат большее количество внехромосомных кольцевых ДНК, приобретают пролиферативное преимущество и проходят, таким образом, положительный отбор в ходе эволюции опухоли [7].
Рассматривая прогрессию опухоли через призму дарвиновской эволюции, можно объяснить и альтернативный вариант — полное исчезновение двойных минихромосом из клетки. Например, при таргетном лечении трастузумабом рака молочной железы (РМЖ) с амплификацией гена Her2/neu примерно у одной трети больных возникает рецидив [8]. Механизмов развития резистентности к таргетной терапии существует много, но один из вариантов заключается в активации работы сигнальных каскадов, перекрывающихся с сигнальным путем Her2/neu, с помощью компенсирующей амплификации генов PIK3CA и c-Met [8], [9]. Так, при лечении трастузумабом метастатического РМЖ с амплификацией Her2/neu в 27,7% случаев обнаруживается и амплификация гена рецептора тирозинкиназы c-Met [10]. Амплификация с-Met берет на себя функцию драйверной, а кольцевые минихромосомы, несущие амплифицированный ген Her2/neu, становятся балластом: они элиминируются из клетки.
На примере появления резистентных к трастузумабу клеток и прогрессии РМЖ, несмотря на лечение, хорошо видно, почему ингибирование только одной молекулярной мишени может оказаться терапевтически неэффективным. Стратегическим направлением клинических исследований сейчас становится воздействие сразу на несколько мишеней (double-hit-лечение). Так, по сравнению с обычной таргетной терапией при немелкоклеточном раке легкого с мутациями гена EGFR, использование комбинированной терапии бевацузимабом и эрлотинибом увеличивает время до прогрессирования заболевания и общую выживаемость больных [11]. Комбинация различных препаратов используется и при лечении меланомы c мутацией в гене BRAF [12]. К сожалению, ни в одном из исследований не описана какая-либо комбинация препаратов, которая бы привела к полному излечению пациентов. Во всех случаях неизбежно развивается резистентность, правда, в более поздние сроки по сравнению с монотерапией.
Пассажир садится за руль
Гены, которые подвергаются амплификации, находятся, как правило, в начале сигнальных каскадов, регулирующих важнейшие клеточные процессы, такие как рост клеток и поддержание целостности и функциональной дееспособности генома. Эти гены являются драйверами процесса канцерогенеза, то есть играют решающую роль в развитии опухоли. Учитывая, что процесс образования кольцевых структур может быть опосредован репарацией двухцепочечных разрывов с помощью негомологичного соединения концов линейной ДНК (non-homologous end joining, NHEJ) — процесса неточного и потенциально ведущего к накоплению мутаций, — можно ожидать, что мутационная нагрузка на вкДНК окажется выше, чем на остальные части опухолевого генома. И действительно, оказалось, что амплификация с образованием внехромосомной кольцевой ДНК может сопровождаться вторичными мутациями, которые изначально не влияют на рост опухоли (за что и получили название «мутации-“пассажиры”»), но способны выступать как потенциальные драйверы опухолевой прогрессии при изменении условий внешней среды, например, если опухоль подвергнется лечению.
Ярким примером того, как мутации-«пассажиры» на внехромосомных кольцевых ДНК, накапливаемые «про запас», обеспечивают дополнительный механизм адаптации опухоли в новых условиях существования, является возникновение резистентности к лечению ингибиторами тирозинкиназы в глиобластомах (злокачественных опухолях головного мозга) с делецией 16 экзона в РНК-транскрипте гена EGFR (EGFRxE16) (рис. 3) [13].
Рисунок 3. Молекулярный профиль внехромосомных кольцевых ДНК опухоли в момент постановки диагноза и после обнаружения рецидива. В каждой из кольцевых минихромосом возможно возникновение дополнительных мутаций (обозначены кружками различных оттенков). вкДНК, несущие ген EGFR дикого типа (wtEGFR), отмечены черными кружками. Кольцевые минихромосомы с мутацией EGFRvIII — синего цвета, с мутацией EGFRxE16 — красного. Объяснения см. в тексте.
В клетках глиобластом возможны несколько различных мутаций гена EGFR. В случае мутации EGFRvIII, которая возникает в результате делеции экзонов 2–7 гена EGFR, опухоль, как и при наличии EGFR «дикого типа», остается чувствительной к терапии ингибиторами тирозинкиназы EGFR, такими как эрлотиниб и др. Напротив, опухоли, содержащие кольцевые минихромосомы с мутацией EGFRxE16, приобретают резистентность к проводимой терапии. Находясь в небольшом количестве клеток опухоли в момент постановки диагноза, с каждым поколением клеток кольцевые минихромосомы с мутацией EGFRxE16 накапливаются и дают начало новому опухолевому клону, преуспевшему в изменившихся условиях окружающей среды больше остальных. Отбор наиболее приспособленных — движущая сила эволюции, и здесь эволюция внутри опухоли поразительно напоминает классическую дарвиновскую эволюцию, предопределяя то обстоятельство, что возникающий через некоторое время рецидив будет представлен именно клоном с мутацией EGFRxE16 на внехромосомной кольцевой ДНК. Другой путь эволюции глиобластом — потеря двойных микрохромосом с мутантным EGFR, что тоже повышает устойчивость к лекарственным препаратам, усиливает злокачественный потенциал опухолевой популяции и объясняет плохой прогноз при данном заболевании [14].
Под окружающей средой в данном случае мы понимаем спектр экспрессии генов и белков, мутации и эпигенетические изменения, уже имеющиеся в этой клетке, опухолевое микроокружение и внешние факторы, такие как препараты, используемые для лечения. В этом конкретном случае изменение окружающей среды — это воздействие на опухоль лекарственным препаратом эрлотиниб.
Когда замкнутость дает преимущества
Возникновение амплификаций и вторичных по отношению к ним точечных мутаций за пределами хромосом имеет глубокий биологический смысл. Так опухоли получают возможность «экспериментировать» с новыми функциями, не нарушая свою жизнедеятельность. К тому же, с помощью амплификаций и других мутаций кольцевой внехромосомной ДНК формируется генетическая гетерогенность (разнородность) опухоли, а процесс ее эволюции идет гораздо быстрее, чем если бы эти процессы происходили исключительно в хромосомах. Это было показано Кристен Тёрнер и ее соавторами с помощью методов математического моделирования [15]. Они обнаружили, что внехромосомная амплификация позволяет достичь более высокого уровня экспрессии онкогена благодаря неравному распределению кольцевой ДНК между дочерними клетками во время митоза. Как и было предсказано моделью, в опухолях, где отмечалось присутствие вкДНК, содержание онкогенов EGFR (включая EGFRvIII) и MYC было значительно более высоким по сравнению с теми, которые не задействовали механизм внехромосомной амплификации. Авторы исследования также пришли к выводу, что если онкоген амплифицируется интрахромосомно, гетерогенность опухоли остается на сравнительно низком уровне.
Существование гетерогенности в опухоли может иметь большое клиническое значение, так как оказывает влияние на развитие заболевания и во многом определяет ответ на лечение [15], [16]. Представим себе опухолевые клетки с полностью идентичным геномом за исключением качественного и количественного спектра внехромосомных кольцевых ДНК. Уже только за их счет опухоль обеспечивает себе огромное разнообразие генотипических и фенотипических вариантов, и высока вероятность, что хотя бы один из них преуспеет больше остальных при изменении условий окружающей среды. Если учесть, что в реальных условиях in vivo опухоль является внутренне гетерогенной за счет генных мутаций и эпигенетических изменений, а также за счет влияния внешних факторов (таких как микроокружение опухоли), то вкДНК делает процесс опухолевой эволюции еще более сложным, приводя к прогрессии заболевания и неудачам в лечении.
На что способна кольцевая ДНК?
Важное открытие последних лет состоит в том, что в неопухолевых клетках также присутствуют внехромосомные кольцевые ДНК. Так, в 2018 году сразу две исследовательские группы продемонстрировали существование вкДНК в здоровых тканях человека [17], [18].
Молекулы кольцевой ДНК, обнаруженные в нормальных клетках, сильно различаются по размеру и генному составу. Часть из этих внехромосомных структур очень мала (менее 25 т.п.н.), другие же достигают 1 миллиона пар нуклеотидов, что сравнимо с двойными минихромосомами опухолей. Надо особо подчеркнуть, что сравнимы внехромосомные кольцевые ДНК опухолевой и нормальной тканей могут быть только по размеру, но не по структуре — в норме амплификации генов на внехромосомной ДНК не происходит.
В составе «нормальной» вкДНК обнаруживаются целые гены и их отдельные участки, межгенные промежутки, повторяющиеся последовательности, ретровирусы, ретротранспозоны, длинные терминальные повторы (LTR) и т.д. Ученые предполагают, что это продукты удаленной из хромосом поврежденной ДНК, которая не сразу элиминируется из клетки, а продолжает существовать в нестабильной кольцевой форме. Был даже предложен новый термин «циркулóм», обозначающий совокупность дополнительных внехромосомных кольцевых молекул ДНК [17]. Интересно, что хромосомы, содержащие наибольшее количество генов, являются и источником самого большого количества внехромосомных кольцевых ДНК [18].
Какую роль может играть эта ДНК в нормальной, неопухолевой клетке? Для ответа на этот вопрос ученым может пригодиться CRISPR/Cas — самая нашумевшая технология последних лет, о которой «Биомолекула» неоднократно писала [19–22].
Технология CRISPR сделала возможным эндогенный биогенез внехромосомной кольцевой ДНК в культуре клеток. Эксперименты были проведены на человеческих клетках почки эмбриона (HEK293T) и фибробластах молочной железы человека (HMF). Но принцип метода универсален и подходит для любых клеточных культур: нужны лишь два различных рибопротеиновых комплекса CRISPR/Cas9, вносящие в ДНК одной и той же хромосомы два двухцепочечных разрыва, а далее дело за клеточной системой репарации NHEJ, превращающей вырезанный кусок в кольцо. С помощью этой технологии была продемонстрирована гипотетическая ранее транскрипционная активность внехромосомной кольцевой ДНК [23]. Показано, что с вкДНК транскрибируются не только мРНК, но и малые некодирующие РНК — микроРНК и короткие интерферирующие РНК, которые могут подавлять экспрессию генов в клетках на уровне трансляции посредством РНК-интерференции [24]. Интересно, что эти линейные молекулы РНК содержат соединительные последовательности, характерные в то же время и для кольцевой РНК, что может привести к потенциальным ошибкам при биоинформатическом анализе данных секвенирования [25]. Поэтому при работе с кольцевой РНК необходимо подтверждать данные РНК-секвенирования (полученные методами «сухой» биологии) с помощью РНК-азы R, нозерн-блоттинга или электрофоретически. Сами же химерные линейные РНК, содержащие соединительные последовательности, характерные для бэксплайсинга (от англ. backsplicing — процесс сплайсинга с последующим соединением концов вырезанного транскрипта «голова к хвосту»), следует рассматривать как еще один тип молекул РНК, которые, возможно, выполняют в организме те же функции, что и кольцевые РНК, и потому заслуживают прицельного изучения.
Транскрипционной регуляцией экспрессии генов функции внехромосомной кольцевой ДНК не ограничиваются. Подобно экзосомам, она может выполнять роль переносчиков генетической информации от клетки к клетке. Межклеточные взаимодействия — это универсальный по своей природе биологический механизм, который лежит в основе существования всех многоклеточных. Процессы межклеточной коммуникации с особым вниманием изучают онкологи, так как, к сожалению, опухоли используют те же самые механизмы коммуникации, что и здоровые клетки. Уже накоплены данные о том, что вкДНК может репрограммировать микроокружение опухоли, участвовать в формировании преметастатических ниш, супрессивно модулировать иммунные клетки, тем самым определяя развитие опухолевого процесса и прогноз заболевания [3], [15–17].
О cGAS-пути иммунного ответа «Биомолекула» писала в статье «Почему прячут ДНК от Стинга?» [26].
Перспективы использования внехромосомной кольцевой ДНК в медицине
Внехромосомная кольцевая ДНК, подобно линейным «осколкам» хромосом, может попадать не только в цитоплазму, но и в кровяное русло. Опухоли участвуют в этом процессе не менее активно, чем здоровые ткани (рис. 4).
Рисунок 4. Источником ДНК для жидкостной биопсии могут быть линейные «осколки» хромосом и внехромосомная кольцевая ДНК, а также экзосомы, циркулирующие опухолевые клетки и клетки нормальных тканей, попадающие в кровяное русло
Количество внехромосомной кольцевой ДНК в крови не всегда коррелирует с размерами опухоли, но также зависит и от ее пролиферативной активности, васкуляризации, скорости деградации и других факторов. К тому же, необходимо помнить, что источником внехромосомной кольцевой ДНК в крови служат не только опухолевые, но и нормальные клетки. Но поскольку вкДНК опухолей обычно больше по размеру, это создает потенциальную возможность использования жидкостной биопсии для определения их динамики при хирургическом и лекарственном лечении злокачественных новообразований различной локализации [27]. Перспективным подходом является и оценка риска рецидива заболевания на основе выявляемых методом жидкостной биопсии закономерностей изменения численности внехромосомных кольцевых ДНК. Однако техническая сложность анализа минимальных различий размера вкДНК из здоровых и опухолевых клеток, необходимость минимизации ложно-положительных результатов и создания крайне чувствительного теста делают клиническое применение внехромосомной кольцевой ДНК опухолей как биомаркера для жидкостной биопсии делом отдаленного будущего. По крайней мере, эксперты американского общества клинической онкологии (ASCO) и коллегии американских патологов (CAP) по этому вопросу настроены скептически [28].
Более реальным выглядит создание лекарственного препарата, прицельно разрушающего внехромосомные кольцевые ДНК в опухолевых клетках и таким образом оказывающего терапевтическое воздействие. Так, уже появилось сообщение о том, что двуцепочечные разрывы, вносимые в структуру вкДНК с помощью CRISPR/Cas9, приводят к их агрегации, включению в состав микроядра и элиминации из клетки [29].
Заключение
Становится очевидным, что внехромосомные кольцевые ДНК играют важную роль в нормальных клетках и клетках опухолей. Будучи широко распространенными практически у всех эукариот, кольцевые ДНК участвуют в транскрипционной регуляции уровня экспрессии различных генов, процессах иммунного ответа, межклеточном взаимодействии и выполняют другие важные функции.
В опухолях же двойные минихромосомы можно рассматривать как резервуар для накопления различных амплификаций и точечных мутаций, причем все эти изменения, что немаловажно, являются обратимыми. Кольцевая ДНК обеспечивает высокую скорость накопления мутаций, которой не удается достичь в линейных хромосомах. И при этом клетка в любой момент может повернуть процесс вспять — если выяснится, что мутация несет потенциальный вред опухоли, вкДНК, ее содержащая, элиминируется из клетки. В конечном итоге именно внехромосомная кольцевая ДНК придает злокачественным новообразованиям пластичность, что делает лечение опухолей такой сложной задачей.
4. Клетка как биологическая система (множественный выбор)
Примеры ответов: 7 или здесьисейчас или 3514
Химический состав клетки
Какие структурные компоненты входят в состав нуклеотидов молекулы ДНК?
Варианты:
Каковы свойства, строение и функции в клетке полисахаридов?
Варианты:
Какие клеточные структуры содержат ДНК кольцевой формы?
Варианты:
Какие функции выполняет в клетке вода?
Варианты:
Какую функцию выполняют в клетке нуклеиновые кислоты?
Варианты:
Выберите признаки РНК.
Варианты:
Какие функции выполняют углеводы в организме животных?
Варианты:
Какие признаки характерны для молекулы ДНК?
Варианты:
Моносахариды в клетке выполняют функции:
Варианты:
Липиды в клетке выполняют функции:
Варианты:
Каковы особенности строения и свойств молекул белков?
Варианты:
Белки и липиды играют роль в образовании:
Варианты:
Что характерно для ферментов?
Варианты:
Какие функции выполняют липиды в организме животных?
Варианты:
Выберите особенности строения молекул белков.
Варианты:
Все приведённые ниже признаки, кроме двух, можно использовать для описания значения белков в организме человека и животных. Определите два признака, «выпадающих» из общего списка, и запишите в ответ цифры, под которыми они указаны.
Варианты:
Все приведённые ниже признаки, кроме двух, можно использовать для определения функций липидов в клетке. Определите два признака, «выпадающих» из общего списка, и запишите в таблицу цифры, под которыми они указаны.
Варианты:
Все перечисленные ниже признаки, кроме двух, можно использовать для описания яичного белка альбумина. Определите два признака, «выпадающих» из общего списка, и запишите в таблицу цифры, под которыми они указаны.
Варианты:
ДНК и гены
ДНК ПРОКАРИОТ И ЭУКАРИОТ
Справа крупнейшая спираль ДНК человека, выстроенная из людей на пляже в Варне (Болгария), вошедшая в книгу рекордов Гиннесса 23 апреля 2016 года
Дезоксирибонуклеиновая кислота. Общие сведения
Дезоксирибонуклеи́новая кислота (ДНК) — макромолекула (одна из трёх основных, две другие — РНК и белки), обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. ДНК содержит информацию о структуре различных видов РНК и белков.
В клетках эукариот (животных, растений и грибов) ДНК находится в ядре клетки в составе хромосом, а также в некоторых клеточных органоидах (митохондриях и пластидах). В клетках прокариотических организмов (бактерий и архей) кольцевая или линейная молекула ДНК, так называемый нуклеоид, прикреплена изнутри к клеточной мембране. У них и у низших эукариот (например, дрожжей) встречаются также небольшие автономные, преимущественно кольцевые молекулы ДНК, называемые плазмидами.
С химической точки зрения ДНК — это длинная полимерная молекула, состоящая из повторяющихся блоков — нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы. Связи между нуклеотидами в цепи образуются за счёт дезоксирибозы (С) и фосфатной (Ф) группы (фосфодиэфирные связи).
Рис. 2. Нуклертид состоит из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы
В подавляющем большинстве случаев (кроме некоторых вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК) макромолекула ДНК состоит из двух цепей, ориентированных азотистыми основаниями друг к другу. Эта двухцепочечная молекула закручена по винтовой линии.
В ДНК встречается четыре вида азотистых оснований (аденин, гуанин, тимин и цитозин). Азотистые основания одной из цепей соединены с азотистыми основаниями другой цепи водородными связями согласно принципу комплементарности: аденин соединяется только с тимином (А-Т), гуанин — только с цитозином (Г-Ц). Именно эти пары и составляют «перекладины» винтовой «лестницы» ДНК (см.: рис. 2, 3 и 4).
Рис. 2. Азотистые основания
Последовательность нуклеотидов позволяет «кодировать» информацию о различных типах РНК, наиболее важными из которых являются информационные, или матричные (мРНК), рибосомальные (рРНК) и транспортные (тРНК). Все эти типы РНК синтезируются на матрице ДНК за счёт копирования последовательности ДНК в последовательность РНК, синтезируемой в процессе транскрипции, и принимают участие в биосинтезе белков (процессе трансляции). Помимо кодирующих последовательностей, ДНК клеток содержит последовательности, выполняющие регуляторные и структурные функции.
Рис. 3. Репликация ДНК
Расположение базовых комбинаций химических соединений ДНК и количественные соотношения между этими комбинациями обеспечивают кодирование наследственной информации.
Образование новой ДНК (репликация)
По завершении дупликации образуются две самостоятельные спирали, созданные из химических соединений родительской ДНК и имеющие с ней одинаковый генетический код. Таким путем ДНК способна перерывать информацию от клетки к клетке.
Более подробная информация:
СТРОЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) относится к нуклеиновым кислотам. Нуклеиновые кислоты – это класс нерегулярных биополимеров, мономерами которых являются нуклеотиды.
НУКЛЕОТИДЫ состоят из азотистого основания, соединенного с пятиуглеродным углеводом (пентозой) – дезоксирибозой (в случае ДНК) или рибозой (в случае РНК), который соединяется с остатком фосфорной кислоты (H2PO3–).
Азотистые основания бывают двух типов: пиримидиновые основания – урацил (только в РНК), цитозин и тимин, пуриновые основания – аденин и гуанин.
Рис. 5. Структура нуклеотидов (слева), расположение нуклеотида в ДНК (снизу) и типы азотистых оснований (справа): пиримидиновые и пуриновые
Атомы углерода в молекуле пентозы нумеруются числами от 1 до 5. Фосфат соединяется с третьим и пятым атомами углерода. Так нуклеинотиды соединяются в цепь нуклеиновой кислоты. Таким образом, мы можем выделить 3’ и 5’-концы цепи ДНК:
Рис. 6. Выделение 3’ и 5’-концов цепи ДНК
Две цепи ДНК образуют двойную спираль. Эти цепи в спирали сориентированы в противоположных направлениях. В разных цепях ДНК азотистые основания соединены между собой с помощью водородных связей. Аденин всегда соединяется с тимином, а цитозин – с гуанином. Это называется правилом комплементарности (см. принцип комплементарности ).
Правило комплементарности:
| A–T G–C |
Например, если нам дана цепь ДНК, имеющая последовательность
3’– ATGTCCTAGCTGCTCG – 5’,
то вторая ей цепь будет комплементарна и направлена в противоположном направлении – от 5’-конца к 3’-концу:
5’– TACAGGATCGACGAGC– 3’.
Рис. 7. Направленность цепей молекулы ДНК и соединение азотистых оснований с помощью водородных связей
РЕПЛИКАЦИЯ ДНК
Репликация ДНК – это процесс удвоения молекулы ДНК путем матричного синтеза. В большинстве случаев естественной репликации ДНК праймером для синтеза ДНК является короткий фрагмент РНК (создаваемый заново). Такой рибонуклеотидный праймер создается ферментом праймазой (ДНК-праймаза у прокариот, ДНК-полимераза у эукариот), и впоследствии заменяется дезоксирибонуклеотидами полимеразой, выполняющей в норме функции репарации (исправления химических повреждений и разрывов в молекле ДНК).
Репликация происходит по полуконсервативному механизму. Это значит, что двойная спираль ДНК расплетается и на каждой из ее цепей по принципу комплементарности достраивается новая цепь. Дочерняя молекула ДНК, таким образом, содержит в себе одну цепь от материнской молекулы и одну вновь синтезированную. Репликация происходит в направлении от 3’ к 5’ концу материнской цепи.
Рис. 8. Репликация (удвоение) молекулы ДНК
ДНК-синтез – это не такой сложный процесс, как может показаться на первый взгляд. Если подумать, то для начала нужно разобраться, что же такое синтез. Это процесс объединения чего-либо в одно целое. Образование новой молекулы ДНК проходит в несколько этапов:
Рис. 9. Схематическое изображение процесса репликации ДНК: (1) Отстающая цепь (запаздывающая нить), (2) Ведущая цепь (лидирующая нить), (3) ДНК-полимераза α ( Polα ), (4) ДНК-лигаза, (5) РНК-праймер, (6) Праймаза, (7) Фрагмент Оказаки, (8) ДНК-полимераза δ ( Polδ ), (9) Хеликаза, (10) Однонитевые ДНК-связывающие белки, (11) Топоизомераза.
Далее описан синтез отстающей цепи дочерней ДНК (см. Схему репликативной вилки и функции ферментов репликации)
Нагляднее о репликации ДНК см. видео →
5) Непосредственно сразу после расплетания и стабилизации другой нити материнской молекулы к ней присоединяется ДНК-полимераза α (альфа) и в направлении 5’→3′ синтезирует праймер (РНК-затравку) – последовательность РНК на матрице ДНК длиной от 10 до 200 нуклеотидов. После этого фермент удаляется с нити ДНК.
СТРОЕНИЕ РНК
Рибонуклеиновая кислота (РНК) — одна из трёх основных макромолекул (две другие — ДНК и белки), которые содержатся в клетках всех живых организмов.
Последовательность нуклеотидов позволяет РНК кодировать генетическую информацию. Все клеточные организмы используют РНК (мРНК) для программирования синтеза белков.
Затем матричные РНК (мРНК) принимают участие в процессе, называемом трансляцией, т.е. синтеза белка на матрице мРНК при участии рибосом. Другие РНК после транскрипции подвергаются химическим модификациям, и после образования вторичной и третичной структур выполняют функции, зависящие от типа РНК.
Рис. 10. Отличие ДНК от РНК по азотистому основанию: вместо тимина (Т) в РНК представлен урацил (U), который также комплементарен аденину.
ТРАНСКРИПЦИЯ
Транскрипция – это процесс синтеза РНК на матрице ДНК. ДНК раскручивается на одном из участков. На одной из цепей содержится информация, которую необходимо скопировать на молекулу РНК – эта цепь называется кодирующей. Вторая цепь ДНК, комплементарная кодирующей, называется матричной. В процессе транскрипции на матричной цепи в направлении 3’ – 5’ (по цепи ДНК) синтезируется комплементарная ей цепь РНК. Таким образом, создается РНК-копия кодирующей цепи.
Рис. 11. Схематическое изображение транскрипции
Например, если нам дана последовательность кодирующей цепи
3’– ATGTCCTAGCTGCTCG – 5’,
то, по правилу комплементарности, матричная цепь будет нести последовательность
5’– TACAGGATCGACGAGC– 3’,
а синтезируемая с нее РНК – последовательность
3’– AUGUCCUAGCUGCUCG – 5’.
ТРАНСЛЯЦИЯ
Рассмотрим механизм синтеза белка на матрице РНК, а также генетический код и его свойства. Также для наглядности по ниже приведенной ссылке рекомендуем посмотреть небольшое видео о процессах транскрипции и трансляции, происходящих в живой клетке:
Рис. 12. Процесс синтеза белка: ДНК кодирует РНК, РНК кодирует белок
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД
Генетический код, общий для большинства про- и эукариот. В таблице приведены все 64 кодона и указаны соответствующие аминокислоты. Порядок оснований — от 5′ к 3′ концу мРНК.
Таблица 1. Стандартный генетический код
Среди триплетов есть 4 специальных последовательности, выполняющих функции «знаков препинания»:
Свойства генетического кода
1. Триплетность. Каждая аминокислота кодируется последовательностью из трех нуклеотидов – триплетом или кодоном.
2. Непрерывность. Между триплетами нет никаких дополнительных нуклеотидов, информация считывается непрерывно.
3. Неперекрываемость. Один нуклеотид не может входить одновременно в два триплета.
4. Однозначность. Один кодон может кодировать только одну аминокислоту.
5. Вырожденность. Одна аминокислота может кодироваться несколькими разными кодонами.
6. Универсальность. Генетический код одинаков для всех живых организмов.
Пример. Нам дана последовательность кодирующей цепи:
3’– CCGATTGCACGTCGATCGTATA– 5’.
Матричная цепь будет иметь последовательность:
5’– GGCTAACGTGCAGCTAGCATAT– 3’.
Теперь «синтезируем» с этой цепи информационную РНК:
3’– CCGAUUGCACGUCGAUCGUAUA– 5’.
Синтез белка идет в направлении 5’ → 3’, следовательно, нам нужно перевернуть последовательность, чтобы «прочитать» генетический код:
5’– AUAUGCUAGCUGCACGUUAGCC– 3’.
Теперь найдем старт-кодон AUG:
5’– AU AUG CUAGCUGCACGUUAGCC– 3’.
Разделим последовательность на триплеты:
Найдем стоп-кодон и согласно таблице генетического кода запишем последовательность аминокислот:
Центральная догма молекулярной биологии звучит следующим образом: информация с ДНК передается на РНК (транскрипция), с РНК – на белок (трансляция). ДНК также может удваиваться путем репликации, и также возможен процесс обратной транскрипции, когда по матрице РНК синтезируется ДНК, но такой процесс в основном характерен для вирусов.
Рис. 13. Центральная догма молекулярной биологии
ГЕНОМ: ГЕНЫ и ХРОМОСОМЫ
Термин «геном» был предложен Г. Винклером в 1920 г. для описания совокупности генов, заключенных в гаплоидном наборе хромосом организмов одного биологического вида. Первоначальный смысл этого термина указывал на то, что понятие генома в отличие от генотипа является генетической характеристикой вида в целом, а не отдельной особи. С развитием молекулярной генетики значение данного термина изменилось. Известно, что ДНК, которая является носителем генетической информации у большинства организмов и, следовательно, составляет основу генома, включает в себя не только гены в современном смысле этого слова. Большая часть ДНК эукариотических клеток представлена некодирующими («избыточными») последовательностями нуклеотидов, которые не заключают в себе информации о белках и нуклеиновых кислотах. Таким образом, основную часть генома любого организма составляет вся ДНК его гаплоидного набора хромосом.
Гены — это участки молекул ДНК, кодирующие полипептиды и молекулы РНК
За последнее столетие наше представление о генах существенно изменилось. Ранее геном называли участок хромосомы, кодирующий или определяющий один признак или фенотипическое (видимое) свойство, например цвет глаз.
В 1940 г. Джордж Бидл и Эдвард Тейтем предложили молекулярное определение гена. Ученые обрабатывали споры гриба Neurospora crassa рентгеновским излучением и другими агентами, вызывающими изменения в последовательности ДНК (мутации), и обнаружили мутантные штаммы гриба, утратившие некоторые специфические ферменты, что в некоторых случаях приводило к нарушению целого метаболического пути. Бидл и Тейтем пришли к выводу, что ген — это участок генетического материала, который определяет или кодирует один фермент. Так появилась гипотеза «один ген — один фермент». Позднее эта концепция была расширена до определения «один ген — один полипептид», поскольку многие гены кодируют белки, не являющиеся ферментами, а полипептид может оказаться субъединицей сложного белкового комплекса.
Современное биохимическое определение гена еще более конкретно. Генами называются все участки ДНК, кодирующие первичную последовательность конечных продуктов, к которым относятся полипептиды или РНК, обладающие структурной или каталитической функцией.
Наряду с генами ДНК содержит и другие последовательности, выполняющие исключительно регуляторную функцию. Регуляторные последовательности могут обозначать начало или конец генов, влиять на транскрипцию или указывать место инициации репликации или рекомбинации. Некоторые гены могут экспрессироваться разными путями, при этом один и тот же участок ДНК служит матрицей для образования разных продуктов.
Мы можем приблизительно рассчитать минимальный размер гена, кодирующего средний белок. Каждая аминокислота в полипептидной цепи кодируется последовательностью из трех нуклеотидов; последовательности этих триплетов (кодонов) соответствуют цепочке аминокислот в полипептиде, который кодируется данным геном. Полипептидная цепь из 350 аминокислотных остатков (цепь средней длины) соответствует последовательности из 1050 п.н. (пар нуклеотидов). Однако многие гены эукариот и некоторые гены прокариот прерываются сегментами ДНК, не несущими информации о белке, и поэтому оказываются значительно длиннее, чем показывает простой расчет.
Сколько генов в одной хромосоме?
ДНК прокариот устроена более просто: их клетки не имеют ядра, поэтому ДНК находится непосредственно в цитоплазме в форме нуклеоида.
Как известно, бактериальные клетки имеют хромосому в виде нити ДНК, уложенной в компактную структуру – нуклеоид. Хромосома прокариота Escherichia coli, чей геном полностью расшифрован, представляет собой кольцевую молекулу ДНК (на самом деле, это не правильный круг, а скорее петля без начала и конца), состоящую из 4 639 675 п.н. В этой последовательности содержится примерно 4300 генов белков и еще 157 генов стабильных молекул РНК. В геноме человека примерно 3,1 млрд пар нуклеотидов, соответствующих почти 29 000 генам, расположенным на 24 разных хромосомах.
Прокариоты (Бактерии).
Бактерия E. coli имеет одну двухцепочечную кольцевую молекулу ДНК. Она состоит из 4 639 675 п.н. и достигает в длину примерно 1,7 мм, что превышает длину самой клетки E. coli приблизительно в 850 раз. Помимо крупной кольцевой хромосомы в составе нуклеоида многие бактерии содержат одну или несколько маленьких кольцевых молекул ДНК, свободно располагающихся в цитозоле. Такие внехромосомные элементы называют плазмидами (рис. 16).
Большинство плазмид состоит всего из нескольких тысяч пар нуклеотидов, некоторые содержат более 10000 п. н. Они несут генетическую информацию и реплицируются с образованием дочерних плазмид, которые попадают в дочерние клетки в процессе деления родительской клетки. Плазмиды обнаружены не только в бактериях, но также в дрожжах и других грибах. Во многих случаях плазмиды не дают никаких преимуществ клеткам-хозяевам, и их единственная задача — независимое воспроизведение. Однако некоторые плазмиды несут полезные для хозяина гены. Например, содержащиеся в плазмидах гены могут придавать клеткам бактерий устойчивость к антибактериальным агентам. Плазмиды, несущие ген β-лактамазы, обеспечивают устойчивость к β-лактамным антибиотикам, таким как пенициллин и амоксициллин. Плазмиды могут переходить от клеток, устойчивых к антибиотикам, к другим клеткам того же или другого вида бактерий, в результате чего эти клетки также становятся резистентными. Интенсивное применение антибиотиков является мощным селективным фактором, способствующим распространению плазмид, кодирующих устойчивость к антибиотикам (а также транспозонов, которые кодируют аналогичные гены) среди болезнетворных бактерий, и приводит к появлению бактериальных штаммов с устойчивостью к нескольким антибиотикам. Врачи начинают понимать опасность широкого использования антибиотиков и назначают их только в случае острой необходимости. По аналогичным причинам ограничивается широкое использование антибиотиков для лечения сельскохозяйственных животных.
Эукариоты.
Таблица 2. ДНК, гены и хромосомы некоторых организмов