Митохондрии. Строение и функции митохондрий клетки.

Митохондрии — органеллы энергообеспечения метаболических процесов в клетке. Размеры их варьируют от 0,5 до 5-7 мкм, количество в клетке составляет от 50 до 1000 и более. В гиалоплазме митохондрии распределены обычно диффузно, однако в специализированных клетках сосредоточены в тех участках, где имеется наибольшая потребность в энергии. Например, в мышечных клетках и симпластах большие количества митохондрий сосредоточены вдоль рабочих элементов — сократительных фибрилл. В клетках, функции которых сопряжены с особо высокими энергозатратами, митохондрии образуют множественные контакты, объединяясь в сеть, или кластеры (кардиомиоциты и симпласты скелетной мышечной ткани).

В клетке митохондрии выполняют функцию дыхания. Клеточное дыхание — это последовательность реакций, с помощью которых клетка использует энергию связей органических молекул для синтеза макроэргических соединений типа АТФ. Образующиеся внутри митохондрии молекулы АТФ переносятся наружу, обмениваясь на молекулы АДФ, находящиеся вне митохондрии. В живой клетке митохондрии могут передвигаться с помощью элементов цитоскелета.

На ультрамикроскопическом уровне стенка митохондрии состоит из двух мембран — наружной и внутренней. Наружная мембрана имеет относительно ровную поверхность, внутренняя — образует направленные в центр складки, или кристы. Между наружной и внутренней мембранами возникает неширокое (около 15 нм) пространство, которое называется наружной камерой митохондрии; внутренняя мембрана ограничивает внутреннюю камеру. Содержимое наружной и внутренней камер митохондрии различно, и так же, как и сами мембраны, существенно отличается не только по рельефу поверхности, но и по ряду биохимических и функциональных признаков. Наружная мембрана по химическому составу и свойствам близка к другим внутриклеточным мембранам и плазмолемме.

Строение митохондрий

Ее характеризует высокая проницаемость, благодаря наличию гидрофильных белковых каналов. Эта мембрана имеет в своем составе рецепторные комплексы, распознающие и связывающие вещества, поступающие в митохондрию. Ферментный спектр наружной мембраны небогат: это ферменты метаболизма жирных кислот, фосфолипидов, липидов и др. Главной функцией наружной мембраны митохондрии является отграничение органеллы от гиалоплазмы и транспорт необходимых для осуществления клеточного дыхания субстратов.

Внутренняя мембрана митохондрий в большинстве клеток тканей различных органов формирует кристы в виде пластин (ламеллярные кристы), что значительно увеличивает площадь поверхности внутренней мембраны. В последней 20-25 % всех белковых молекул составляют ферменты дыхательной цепи и окислительного фосфорилирования. В эндокринных клетках надпочечников и половых желез митохондрии участвуют в синтезе стероидных гормонов. В этих клетках митохондрии имеют кристы в виде трубочек (тубул), упорядоченно расположенных в определенном направлении. Поэтому кристы митохондрий в стероидпродуцирующих клетках названных органов именуются тубулярными.

Матрикс митохондрии, или содержимое внутренней камеры, представляет собой гелеобразную структуру, содержащую около 50 % белков. Осмиофильные тельца, описанные при электронной микроскопии, — это резервы кальция. Матрикс содержит ферменты цикла лимонной кислоты, катализирующие окисление жирных кислот, синтез рибосом, ферменты, участвующие в синтезе РНК и ДНК. Общее число ферментов превышает 40.

Помимо ферментов, матрикс митохондрии содержит митохондриальную ДНК (митДНК) и митохондриальные рибосомы. Молекула митДНК имеет кольцевидную форму. Возможности внутримитохондриального белкового синтеза ограничены — здесь синтезируются транспортные белки митохондриальных мембран и некоторые ферментные белки, участвующие в фосфорилировании АДФ. Все остальные белки митохондрии кодируются ядерной ДНК, и их синтез осуществляется в гиалоплазме, и в дальнейшем они транспортируются в митохондрию. Жизненный цикл митохондрий в клетке короткий, поэтому природа наделила их двойственной системой воспроизводства — помимо деления материнской митохондрии, возможно образование нескольких дочерних органелл путем почкования.

Источник

Митохондрии в клетках организма: раб или большой начальник?

В Главном здании МГУ имени М.В. Ломоносова состоялась лекция доктора биологических наук, профессора Дмитрия Борисовича Зорова «Митохондрии и болезни».

Митохондрия – это органоиды в клетках, являющиеся источником энергии для этих клеток. Они считаются частью клетки и отвечают за превращение органических веществ из пищи в энергию для тела.

«Самое важное значение этой органеллы состоит в том, что она вырабатывает аденозинтрифосфат (АТФ). Проще говоря, является «электростанцией» в нашем организме, без нее клетки не могут полноценно функционировать – постепенно «старятся» и погибают», – комментирует лектор.

В 1926 году Айвен Уоллин предположил, что митохондрии когда-то были самостоятельно живущими бактериями, а в процессе эволюции стали частью нашего организма. Даже находясь внутри человеческой клетки, митохондрия продолжает оставаться самостоятельной: у нее есть своя «кухня» по синтезу белка, включая и собственные молекулы ДНК и РНК.

Сегодня снова перед научным миром встает вопрос, что представляет собой митохондрия?

«Известно, что у митохондрии 1 500 собственных белков, и каждый из них имеет определенную функцию. Так, только часть белков отвечает за энергообразование, у другой же части белков – иные задачи. Революция произошла в 1996 году, когда митохондрии приписали новую роль – участие в клеточной гибели», – объясняет Зоров.

Существует 14 разных видов гибели клеток. В этот момент митохондрия «выпускает» из себя разные сигнальные вещества, которые можно рассматривать, как инициаторов окончательного процесса гибели клеток. Казалось бы, эта «убийственная» функция нежелательна, не нужна организму, однако, это не так. Ведь клетки в организме человека – разные, некоторых из них делятся. Если отменить деление клеток – организму будет «плохо», если же запретить уничтожение клеток – в организме могут начать развиваться фатальные процессы. Например, возникновение раковой опухоли.

При нарушении работы этих незаметных нам «энергоблоков» начинаются проблемы с энергообменом в клетке. При легких формах нарушения человек не выдерживает простых физических нагрузок, которые он способен переносить, исходя из своего возраста. Более серьезные нарушения провоцируют необратимые изменения в энергообмене, и как следствие, сильные нарушения в работе клеток.

«Для митохондрий не присуще рекомбинирование генов, но при этом скорость мутации значительно выше. Во время деления митохондрии распределение генов между новыми клетками имеет совершенно случайный характер. Вероятность возникновения мутации от 1 до 99%. Причем спрогнозировать ее нет никакой возможности. И чем больше больных генов, тем больше вероятность нарушения», – говорит Дмитрий Борисович.

Может ли человек сам влиять на работу митохондрий для предотвращения «коллапсов»?

«На самом деле, мы можем достаточно легко увеличить количество митохондрий в нашем организме и даже улучшить качество их работы. К слову, сделать это помогают фитнес-тренировки. Митохондрии не могут эффективно работать без кислорода. Именно физические нагрузки способствуют увеличению количества митохондрий и изменению их формы», – поясняет Зоров.

А что происходит в старости?

Когда основная масса митохондрий будет повреждена свободными радикалами или их количество резко сократится, то они не смогут производить достаточное количество энергии для поддержания жизни – наступает старение мышечных волокон человека. Это отражается на внутренних органах, которые начинают чахнуть.

«Однако если митохондриям дать возможность эффективно генерировать энергию, занимаясь физическими нагрузками аэробного характера, поддерживая низкокалорийную диету, то старение организма происходит не так стремительно», – подытоживает ученый.

Источник

Митохондрии – маленькие труженики или большие начальники?

Если вы думаете, что самая важная для нас история совместной жизни начинается во время свадьбы, то это совсем не так. Самая важная история совместной жизни каждого человека началась более миллиарда лет назад, когда наши далекие одноклеточные предки вынуждены были подписать «брачный контракт» с теми, кого мы сейчас называем митохондрии (см. теория симбиогенеза).

Митохондрии имеют две мембраны (внутреннюю и внешнюю) и собственный наследственный материал в виде ДНК (рис.1). На внутренней мембране митохондрий находится система окислительного фосфорилирования, работа которой обеспечивает окисление энергетических субстратов с образованием АТФ.

Рис. 1. Схематическое строение митохондрии

«Как белка в колесе» — динамика митохондрий

Не вся вина за метаболические нарушения лежит на нашем переедании. Метаболические нарушения связывают, в первую очередь, с неспособностью митохондрий справиться с питательными веществами. Митохондриям в клетке приходится нелегко. Мы «кормим» свои клетки то слишком много, то слишком мало, а предъявляем им «заявку» выдать энергию в виде АТФ, количество которой точно должно соответствовать нашим потребностям. Для того чтобы регулярно «выкручиваться» из этой ситуации митохондрии и правда используют некоторые «движения» — деление (fission) и слияние (fusion). Эти «митодвижения» объединяют под названием «динамика митохондрий». Баланс между делением и слиянием митохондрий — центральный механизм биоэнергетической адаптации к метаболическим потребностям клетки [2, 3].

Больше всего митохондрий находится в тканях с высокими энергетическими потребностями, — мышцы, печень, бурая жировая ткань, мозг. Неудивительно, что и динамика митохондрий в этих тканях изучена лучше.

Итак, если в клетку какой-либо из этих тканей (кроме некоторых нейронов в мозге, об этом потом) поступает большое количество питательных веществ (поступление превышает затраты), то митохондрии находятся в разделенном (фрагментированном) состоянии. Если клетка находится в состоянии голода (поступления меньше затрат), то происходит слияние митохондрий и они находятся в соединенном состоянии. [3,4]. Так поддерживается гомеостаз клетки (рис.2).

Рис. 2 Регулирование морфологии и биоэнергетической эффективности митохондрий в ответ на избыточное или недостаточное поступление питательных веществ [из 2]

Клеточный метаболический гомеостаз зависит от баланса между потреблением питательных веществ и их расходом. Перемены в поставке питательных веществ приводит к клеточным адаптациям для восстановления баланса. Избыток питания приводит к фрагментации митохондриальной сети, что вызывает снижение биоэнергетической эффективности митохондрий. Это позволит избежать потерь энергии. Напротив, при метаболическом голоде митохондрии удлиняются, чтобы увеличить свою биоэнергетическую эффективность.

В чем хитрость этих движений? Если клетка находится в состоянии голода, то слияние митохондрий позволяет увеличить их биоэнергетическую эффективность (количество АТР, которое создается на молекулу питательного вещества). Если же в клетку поступает избыток питательных веществ, то их можно либо 1) запасти, либо 2)рассеять эту энергию в виде тепла. Задача митохондрий в этом случае, — рассеять больше энергии в виде тепла, запасти меньше в виде АТФ (накопление NADH и АФК приведет к окислительному стрессу). Фрагментация митохондрий позволяет им снизить биоэнергетическую эффективность, главным механизмом снижения которой считается «утечка» протонов.

Так что, мы ходим на работу, а жизнь митохондрий постоянно протекает в режиме цикла деления и слияния (рис 3).

Рис.3 Баланс энергопотребления и энерогообеспечения связан с соответствующими изменениями архитектуры митохондрий и их биоэнергетической эффективностью [из 3]
Физиологические процессы, связанные с увеличением спроса на энергию и снижением энергопоставок, (например, острый стресс, голодание и фаза G1/S) характеризуются удлинением митохондрий и дыханием, связанным с синтезом АТФ. С другой стороны, физиологические процессы, связанные с уменьшением спроса на энергию и увеличением ее поставок (высокий уровень питательных веществ, ожирение и диабет типа 2), связаны с фрагментацией митохондрий, выделением тепла или снижением функции митохондрий.

Здоровые циклы деления и слияния – залог метаболического здоровья клетки

Нормальный цикл деления митохондрий и их слияния является ключевым звеном контроля их качества. Почему? При делении митохондрий образуется две дочерние, одна из которых имеет более высокий мембранный потенциал и идет дальше в цикл слияния-деления, а другая, с более деполяризованной мембраной, остается отделенной до восстановления мембранного потенциала. Если потенциал восстанавливается, — она воссоединяется с митохондриальной сетью. Если она остается деполяризованной, то она элиминируется в процессе аутофагии, что является залогом качества пула митохондрий (рис.4).

Длительное ингибирование деления митохондрий (при длительном клеточном голодании) приводит к накоплению поврежденных митохондрий, которые не могут быть сегрегированы [3, 4].

С другой стороны, избыток питательных веществ приводит к ингибированию слияния митохондрий, что приводит к нарушению цикла митохондриальной динамики, увеличивает внутриклеточную митохондриальную гетерогенность. Да, при избытке еды фрагментация митохондрий протективна, однако длительная фрагментация, как и длительное слияние, вредна для контроля качества митохондрий. Не происходит селективного удаления, митохондриальная масса будет уменьшаться и состоять из небольших деполяризованных митохондрий.

Рис.4 Жизненный цикл митохондрий и его регулирование доступностью питательных веществ [из 3]

Митофузины – не просто какие-то белки

На молекулярном уровне слияние митохондрий является двухстадийным процессом, который требует координированного слияния внешней и внутренней мембран в ходе отдельных последовательных событий. У млекопитающих этот процесс регулируется тремя белками, которые относятся к GTPазам: Mfn1 и Mfn2 необходимы для слияния внешней мембраны, а ОРА1 – для слияния внутренней мембраны. Для деления нужны другие белки, — Fis1 и Drp1.

Роль белков-митофузинов была изучена в loss- and gain-of function studies. Мышки, мутантные по белкам-митофузинам, погибают еще в mid-gestation, потому что у них невозможным становится слияние митохондрий. Митофузины важны для процессов аутофагии и митофагии. Снижение экспрессии Mfn2 в кардиомиоцитах блокирует запуск процесса аутофагии, потому что блокируется слияние аутофагосом с лизосомами. Истощение Mfn2 приводит к снижению потенциала мембран митохондрий, для компенсации происходит снижение работы дыхательной цепи, возрастает поглощение глюкозы и снижается синтез гликогена. Клетка переходит на анаэробный глиоклиз, а это – путь к онкологическому перерождению клетки. Дефицит Mfn2 приводит к нейродегенеративным изменениям. Повышение экспрессии Mfn2 в скелетных мышцах повышает их чувствительность к инсулину.

Mfn1 выполняет сходные функции, однако, вероятно, в других тканях (экспрессия Mfn2 и Mfn1 различается в разных тканях) – Mfn1 экспрессируется в большей степени в сердце, печени, поджелудочной, яичках, а Mfn2 в сердце, скелетных мышцах, мозге, бурой жировой ткани.
Таким образом митофузины являются ключевыми регуляторами динамики митохондрий. Экспрессия митофузинов различна в различных органах, они обеспечвают биоэнергетическую эффективность и механизмы адаптации к доступности питательных веществ, а также от них зависит «судьба» клетки. Не удивительно, что митохондриальные fusion белки являются потенциальными таргетами фармакологических вмешательств [2, 5].

Гипоталамус, митохондрии, метаболическая дисфункция и старение

Динамика митохондрий важна во всех клетках. В бета-клетках поджелудочной железы митохондрии являются сенсорами питательных веществ и генераторами сигналов синтеза инсулина, в мышцах динамика митохондрий важна для регуляции метаболизма глюкозы и т.д. Однако человек не просто совокупность клеток разного типа, каждая из которых принимает самостоятельные решения. Организм – это система, у которой есть центральное регуляторное звено поддержания гомеостаза энергии и глюкозы. Этим главным регулятором является гипоталамус.

Гипоталамус расположен в промежуточном мозге и именно он обеспечивает взаимосвязь нервной и гуморальной систем регуляции. Нейроны гипоталамуса воспринимают, обрабатывают и реагируют на сигналы от жировой ткани (лептин), поджелудочной железы (инсулин), и прочие гормональные стимулы (грелин, холецистокинин, панкреатический полипептид и др.). Гипоталамус управляет деятельностью эндокринной системы человека благодаря тому, что его нейроны способны выделять нейроэндокринные трансмиттеры, стимулирующие или угнетающие выработку гормонов гипофизом. Иными словами, гипоталамус, масса которого не превышает 5 % мозга, является центром регуляции эндокринных функций и поддержания гомеостаза всего организма.

Еще Дильман (Дильман В. М «Большие биологические часы») указывал на ведущую роль гипоталамуса в планомерном развитии метаболической дисфункции, приводящей к ожирению, сахарному диабету, сердечно-сосудистым, онкологическим заболеваням и старению. Согласно сформированной Дильманом теории гиперадаптоза чувствительность рецепторов гипоталамуса к сигналам, поступающим от тканей организма (лептин, инсулин и др.) постепенно планомерно снижается с возрастом. Для того, чтобы вызывать его «ответ» нужно все больше и больше того или иного гормона, — больше инсулина, больше лептина. Развивается инсулин- и лептинрезистентность, метаболические заболевания, приводящие к старению и смерти.

В зависимости от выполняемых функций группы нейронов объединяют в ядра гипоталамуса. Одно из них – аркуатное (дугообразное) ядро является ключевым регулятором пищевого поведения и обмена веществ. В нем могут образовываться орексигенные нейропептиды (стимулируют аппетит) и анорексигенные (подавляют аппетит), относящиеся, соответственно к AgRP и POMC нейронам. Периферические сигналы (инсулин, грелин, лептин и др) влияют на экспрессию пептидов, стимулирующих либо подавляющих аппетит, что обеспечивает слаженность центральной регуляции (рис.5).

Рис. 5. Гипоталамический контроль метмболизма энергии. Мозг интегрирует метаболические сигналы (лептин, инсулин, грелин, PYY3-36) от периферических тканей, таких как поджелудочная железа, жировая ткань, желудок. В мозге специализированные нейронные сети координируют адаптивные изменения в поглощении и расходе пищи [из 5].

Так кто и как регулирует чувствительность нейронов гипоталамуса?

Изучение динамики митохондрий в тканях мозга показало, что динамика митохондрий играет существенную роль в способности нейронов гипоталамуса контролировать уровень глюкозы и гомеостаз энергии в организме [6,7,8].

В AgRP нейронах (hunger-promoting AgRP neurons), которые стимулируют аппетит и регулируют набор массы, голодание приводит к делению митохондрий, а high-fat feeding – к слиянию. То есть ответ митохондрий отличается от такового в большинстве других клеток.

Слияние МХ в этих нейронах регулирует электрическую активность в ответ на высокожировую диету, стимулируя выработку орексигенного пептида (AgRP пептида) оно необходимо для набора веса и отложения жира при избытке питательных веществ. Делеции Mfn1 и Mfn2 в этих нейронах приводили к меньшему набору веса у крыс за счет снижения уровня циркулирующего лептина.

РОМС нейроны (подавляют аппетит) имеют противоположную функцию, и динамика митохондрий в ответ на поступление питательных веществ у них иная. Снижение экспрессии митофузинов в этих нейронах приводит к нарушению связи митохондрий с ЭПС, а в результате – гиперфагия, лептинрезистентность и ожирение. При этом возрастало употребление пищи, а энергозатраты снижались.

Таким образом, ответ организма на высокожировую диету зависит от паттернов динамики митохондрий в нейронах гипоталамуса. Ремоделирование митохондрий в нейронах обеспечивает их ответ на поступление в организм питательных веществ, стимулирует выработку нейропептидов, которые будут либо стимулировать либо подавлять аппетит, влияя на метаболизм на уровне организма (Рис.6).

Рис.6. Метаболическая адаптация к стимулам окружающей среды [из 2]

В ответ на экзогенные стимулы Mfns вовлечены в трансдукцию метаболического сигналинга в разных органах, что обеспечивает поддержание гомеостаза энергии всего организма. В частности, в ответ на потребление пищи, изменения температуры, стресс или физические упражнения, бурая жировая ткань, мозг, сердце или скелетные мышцы адаптируют свой метаболизм для контроля питания, веса тела, сократительных функций, антиоксидантного ответа или чувствительности к инсулину.

Как повлиять на динамику митохондрий?

1. Питание и физические упражнения

Циклы питания Избыток пищи и высокожировая диета (HFD) ингибирует слияние митохондрий в клетках (в некоторых нейронах мозга механизм иной). Незавершенный цикл деления-слияния митохондрий нарушает процессы аутофагии → увеличивается внутриклеточная гетерогенность митохондрий → не происходит селективного удаления митохондрий → накапливаются митохондрии с дисфункцией.

Calorie restriction (fed/fasting cycle) стимулирует биоэнргетическую адаптацию, обеспечивая работу механизмов качества митохондрий.

2. Здоровые мембраны: стеариновая кислота, кардиолипин, фосфатидная кислота

От «здоровья» мембран митохондрий зависят все ключевые процессы, — аутофагия, митофагия, апоптоз, связь митохондрий с эндоплазматической сетью, динамика митохондрий. Мембраны клеточных органелл состоят из липидов и из белков. Ремоделирование этих мембран контролируется взаимодействиями между специфическими липидами и белками.

К насыщенным жирным кислотам относится пальмитиновая (С16) и стеариновая (С18). Показано, что употребление стеариновой кислоты (C18:0) стимулирует процесс слияния митохондрий. Действие ее связано с влиянием на митофузины. У мышей диетические добавки стеариновой кислоты могут частично восстанавливать митохондриальную дисфункцию, вызванную мутациями в генах Pink1 или parkin. В нейтрофилах людей, находящихся 2 дня на low-С18:0 диете, митохондрии находятся во фрагментированном состоянии (50% клеток имели фрагментированные МХ, 10 % соединенные МХ). Употребление стеариновой кислоты приводило у них к слиянию митохондрий через 3 часа [8]. Таким образом., стериновая кислота важна для поддержания циклов динамики митохондрий. Больше всего стеариновой кислоты находится в какао-бобах (31-34 %).

Фосфолипиды – основные компоненты мембран органелл. Они также регулируют динамику митохондрий, при этом их влияние различно [9].

Кардиолипин (СL) стимулирует деление митохондрий и слияние внутренних мембран.

Кардиолипин необходим для работы комплекса IV (цитрохром С оксидазы) электронтранспортной цепи. Кардиолипин находится практически исключительно во внутренней мембране митохондрий. С возрастом происходит снижение количества кардиолипина. Есть теория, что потеря функции кардиолипина связана с заменой насыщенных жирных кислот в его молекуле полиненасыщенными жирными кислотами. Для решения этого вопроса необходимо вводить в рацион насыщенные жиры, богатые, в первую очередь, стеариновой жирной кислотой.

Для повышения эффективности доставки насыщенных жирных кислот в мембрану возможно использование переносчиков. Например, – использование насыщенного фосфатидилхолина (дипальмитофосфатидилхолин и дисероилфосфатидилхолин), который, потенциально, сможет доставить насыщенные ЖК прямо в кардиолипин [10]. Холин, как переносчик, легко проходит через цитозоль и поступает в митохондрии.

Фосфатидная кислота (РА) ингибирует митохондриальное деление и стимулирует слияние внешних мембран (рис.7).

Рис.7 Регулирование слияния митохондрий фосфатидной кислотой (PA) и кардиолипином (CL) [из 9].

Во внешней мембране (ОМ) РА стимулирует митофузин-опосредованное (Mfn) слияние. Во внутренней мембране (IM) CL стимулирует Opa1-опосредованное слияние. Сокращения: ER — эндоплазматический ретикулум; MitoPLD,- митохондрия-локализованная фосфолипаза D.

3. Регуляция экспрессии митофузинов (белков, отвечающих за динамику митохондрий)

Все, о чем мы говорили выше (сalorie restriction, стеариновая кислота, фосфолипиды) действуют, влияя на экспрессию митофузинов.

Помимо этого, есть ряд препаратов, которые опосредованно могут влиять на динамику митохондрий. К ним можно отнести использование метформина.

Наиболее интересным является использование веществ, которые способны напрямую влиять на экспрессию митофузинов. Одним из потенциальных препаратов назван лефлюномид (leflunomide), который был одобрен FDA [5,11]. Он является индуктором экспрессии Mfn1 и Mfn2, а зарегистрирован был как препарат для лечения ревматоидного артрита.

Генная терапия митохондрий

Нарушение динамики митохондрий может быть связано с нарушением экспрессии белков, отвечающих за слияние и деление митохондрий. Помимо этого, нарушение функции этих белков может быть связано (и это и происходит чаще всего) с их мутациями. Тут есть два подхода к рассмотрению причинно-следственных взаимодействий нарушения функции митохондрий.

Ранее считалось, что образ жизни, в том числе переедание, приводит к образованию свободных радикалов, окислительному стрессу, мутациям митохондриального генома и, последовательно, нарушениям функциии митохондрий. Однако, в последнее время есть убедительные доказательства того, что мутации митохондриальной ДНК неизбежны, есть у всех (heteroplasmic DNA point mutations) и связаны с ошибками репликации, а не с оксидативными повреждениями, к которым митохондриальная ДНК довольно устойчива [12]. Уже на этапе оплодотворенной яйцеклетки часть наших митохондрий несут мутации. Со временем они делятся, мутантных митохондрий становится больше, они не могут нормально выполнять свою функцию.

Рис. 8 Клональное экспансия мутированных молекул мтДНК может приводить к митохондриальной дисфункции или может быть «спасено» компенсационным биогенезом [из 12].

Тут очень кстати можно было бы использовать редактирование генома митохондрий in vivo. Было показано, что для heteroplasmic DNA point mutations у мышей уже был достигнут значительный успех при помощи targeted zinc-finger nucleases (mtZFN) с доставкой при помощи аденовирусного вектора [13].

Перенос митохондрий

Другой многообещающий метод устранения дисфункции митохондрий – это трансплантация митохондрий. Суть этого подхода сводится к «замене» поврежденных митохондрий здоровыми экзогенными митохондриями. Впервые данный подход был использован клинически у детей с ишемией миокарда. Для трансплантации использовали аутологичные изолированные митохондрии, которые изолировали при прямой мышцы живота (делали биопсию, а затем готовили препарат), а затем вводили путем прямой инъекции [14]. Прорабатываются различные подходы введния митохондрий: прямое инъецирование изолированных митохондрий (локальное введение) и системное введение в кровоток, когда митохондрия сама «ищет» в какую клетку ей отправиться. Группы исследователей изучают возможность трансплантации митохондрий при болезни Паркинсона, ишемии печени, инсульте, митохондриальных заболеваниях [15].

Рис.9 Способы доставки экзогенных митохондрий в клетку

Источник

Митохондрии: как позаботиться о них и о своем здоровье?

Крошечные структуры внутри наших клеток связаны с болезнями сердца, старением и депрессией. Вот все, что нужно об этом знать

Примерно 2,5 млрд лет назад на Земле была заключена эпохальная сделка. Как гласит теория симбиогенеза, одноклеточные организмы, тогда еще не умевшие использовать кислород для жизни, приняли в себя бактерии, которые обладали этим ценным навыком, и так обзавелись собственными мини-фабриками по быстрому производству энергии.

Результат этой успешной бизнес-стратегии — наши митохондрии. Хоть эти крошечные органеллы (уменьшительное от «органа») давно живут внутри клеток, занимая около 25% их объема, они, похоже, не забыли о том, что когда-то были бактериями — у них, например, есть собственная ДНК. Стоит помнить об этом и нам, чтобы знать их слабые места и обеспечивать им правильное техобслуживание.

А это важно, потому что митохондрии выполняют много ключевых функций — от снабжения организма энергией до регулирования иммунитета. Именно проблемы с митохондриями многие ученые считают основной причиной старения и развития рака, сердечно-сосудистых заболеваний, диабета и болезней Паркинсона и Альцгеймера. Даже ментальные нарушения, возможно, связаны со сбоями в их работе.

Митохондрии и старение

Главная задача митохондрий — обеспечить организм энергией. Любой фабрике для производства нужно не только оборудование, но и сырье. Для митохондрий это сырье — глюкоза и жиры, которые мы получаем с пищей, и кислород, который мы вдыхаем: митохондрии используют 80% его объема из каждого вдоха.

Клетка перерабатывает сырье (глюкозу и жиры) в понятные для митохондрии метаболиты. Их митохондрия прогоняет с помощью кислорода через восемь последовательных реакций (они называются циклом Кребса) и превращает в топливо для наших клеток — АТФ. Задача этой молекулы — легко распадаться, выделяя максимум энергии, которую клетки направляют на строительные нужды. Синтез белков, запасание углеводов и жиров в организме и просто поддержание жизни — для всего этого нужно много АТФ. Впрочем, абсолютное количество этого вещества в организме не так велико — всего около 60 г, но АТФ постоянно распадается и воссоздается, и общий суточный оборот его примерно равен массе вашего тела.

Ни один механизм не совершенен. Наши внутриклеточные фабрики по производству АТФ — тоже. Когда митохондрия превращает глюкозу и кислород в энергию, образуется побочный продукт — активные формы кислорода. Они нестабильны и могут участвовать в совершенно ненужных реакциях, повреждая при этом клеточные структуры. Их влияние должны компенсировать антиоксиданты — активные формы азота или специальные белки. Они реагируют с активными формами кислорода и превращают их в безопасные соединения.

Вот как, например, описан механизм старения в потрясающем исследовании, опубликованном в Nature. Ученые создали генетически измененных мышей, клетки которых синтезировали и использовали дефектный рабочий белок. Обычно этот белок копирует митохондриальную ДНК перед тем, как митохондрия делится. Но дефектный белок при копировании не повторял ДНК дословно, а вносил случайные ошибки. В результате митохондриальные мутации у мышей накапливались быстрее, чем у обычных. При рождении и в раннем подростковом возрасте мыши-мутанты развивались нормально, но потом быстро приобретали старческие недуги: худели, теряли подкожный жир и лысели, у них развивались кифоз, остеопороз и анемия, фертильность снижалась, а сердце аномально увеличивалось. Такие мыши жили недолго.

Митохондрии и мозг

Основной потребитель энергии митохондрий — мозг: ему нужно в 10 раз больше кислорода и глюкозы, чем другим тканям. Потому дисфункция митохондрий еще и приводит к гибели нейронов, а гибель нейронов — к нейродегенерации и болезням Альцгеймера и Паркинсона, предполагают ученые.

Чтобы понять, как дисфункция митохондрий связана с болезнью Паркинсона, исследователи из Великобритании и Германии проанализировали состояние митохондрий и мозга здоровых пожилых людей и пожилых с болезнью Паркинсона. Сначала они взяли образцы мозга, тонко порезали и опустили в специальный краситель. Этот краситель связывается с одним из белков, который митохондрии используют для синтеза АТФ, — цитохромом С. Потом отмыли ткани мозга. Нейроны покрасились, но особенным образом: чем ярче окрас, тем больше цитохрома С в нейроне и тем здоровее митохондрии.

Яркие нейроны с большим количеством цитохрома С оказались у здоровых пожилых людей. У людей с болезнью Паркинсона нейроны окрасились не так ярко. Их митохондрии страдали от дефицита белка и хуже превращали кислород и глюкозу в энергию: у них попросту не хватало оборудования.

Возник новый вопрос: почему в митохондриях людей с болезнью Паркинсона так мало цитохрома С? Ученые предположили: ген митохондрий повредился так неудачно, что они не производят достаточно этого белка. Так и оказалось: информация потерялась, а почему — неизвестно. Поврежденные нейроны с неполным геномом были и у здоровых, и у больных пожилых людей. При Паркинсоне их просто было намного больше, а у здорового молодого человека — не было вовсе.

Как именно здоровье митохондрий влияет на нейроны? Исследовать мозг живого человека сложно, поэтому обратимся к исследованиям на мышах. Но сначала вспомним важную вещь: чтобы синтезировать АТФ, митохондрии добывают энергию из кислорода и еды. Но не вся эта энергия идет на синтез АТФ. Часть митохондрии тратят на обогрев тела, часть — на образование активных форм кислорода. А чтобы рассеивать энергию в виде тепла и согреть тело, у митохондрий есть специальные белки.

С этими белками и поиграли ученые, создав мышей с дефектами: одни не могли эффективно синтезировать белки для рассеивания тепла, другие — наоборот, синтезировали их больше обычного. Митохондрии мышей с недостатком белков-энергоотводов производили больше активных форм кислорода: энергии просто некуда было деться. У этих мышей еще и было меньше митохондрий в нейронах. То есть нейроны получали и больше вреда, и меньше энергии. Потом ученые использовали на мышах нейротоксин, который вызывает гибель нейронов и Паркинсон. Мыши с недостатком белков заболевали гораздо быстрее.

Митохондрии и иммунитет

Бактерия слилась с клеткой, стала производить для нее энергию — и стала митохондрией. Скорее всего, изначально эта бактерия обеспечивала хозяина еще и защитой. Активные формы кислорода она использовала, чтобы разрушить и переварить захваченные клеткой патогены — бактерии или вирусы. Возможно, именно это сотрудничество стало нашей иммунной системой.

Сейчас митохондрии помогают организму быстро и эффективно реагировать на травмы. Когда клетки повреждаются, высвобождается митохондриальная ДНК — и попадает в кровь. Митохондриальная ДНК похожа на бактериальную, поэтому организм считывает это как сигнал опасности и активирует иммунный ответ.

А еще митохондрии активируют иммунные клетки. Например — макрофаги. Когда макрофаги получают от организма сигнал, что в тело проник патоген, митохондрии макрофагов переквалифицируются из энергостанций в военные сооружения. Они перестают синтезировать АТФ и полностью переходят на синтез активных форм кислорода. Активные формы кислорода, во-первых, говорят организму, что самое время начать сражение с патогеном, а во-вторых, и сами могут его уничтожить.

Митохондрии активны и в Т-клетках. Это спецагенты иммунитета, которые проверяют другие клетки на наличие вирусов, а если находят заболевшие — уничтожают. Как и другие митохондрии, митохондрии Т-клеток сливаются друг с другом и, наоборот, разделяются, меняют форму и размер, чтобы адаптировать процесс производства энергии к состоянию организма. Когда все спокойно, они длинные: это помогает эффективнее работать и производить меньше активных форм кислорода. Но когда организм идентифицирует угрозу (это может быть физическая травма, например), митохондрии Т-клеток фрагментируются — и в крови становится много коротких сегментов митохондриальной ДНК. В таком состоянии митохондрии образуют больше активных форм кислорода и тем самым дают иммунитету понять, что пора действовать.

Митохондрии и психика

Когда мышь испытывает психологический стресс, ее Т-клетки активируются, а митохондрии фрагментируются так же, как если бы ее организм столкнулся с вирусом. Если же создать таких мышей, Т-клетки которых всегда активны, а митохондрии — фрагментированы, они будут тревожными, заторможенными, нелюбопытными и лишенными всякой мотивации. А это уже классическая депрессивная симптоматика. Что ставит перед учеными новый вопрос: что, если митохондрии виноваты в проблемах с настроением у человека?

Чтобы проверить гипотезу, исследователи заставили крыс конкурировать за социальную иерархию. Доминирующие позиции заняли животные с меньшим уровнем тревожности. Потом ученые изучили митохондрии прилежащего ядра мозга крыс — отдела, который регулирует эмоции и поведение что у грызунов, что у людей. Оказалось, у крыс-аутсайдеров митохондрии функционируют хуже. А еще в них меньше белков для превращения кислорода и глюкозы в энергию — то есть не хватает оборудования, чтобы митохондрия работала эффективно. Различие оказалось врожденным.

Неизвестно, делают ли нас, людей, тревожными и депрессивными врожденные особенности митохондрий так же, как и грызунов. Но на стресс митохондрии человека реагируют тем же образом. В одном эксперименте, например, людей подвергли стрессу: обвинили в краже или нарушении ПДД — и заставили за две минуты продумать стратегию защиты. В крови участников увеличилось количество митохондриальной ДНК, которая активировала иммунную реакцию, — совсем как в случае с мышами.

Как оценить состояние митохондрий?

Надежного и доступного не-ученым теста для оценки состояния митохондрий пока нет, хотя изобрести его исследователи пытаются. По словам биолога-физиолога, научного сотрудника Университета 2035 Екатерины Зворыкиной, все же есть два метода, которые позволяют примерно понять, насколько корректно они работают.

I. Эргоспирометрия

Простой способ оценить функциональность митохондрий — эргоспирометрия, которую регулярно делают спортсмены. До и во время выполнения физической нагрузки у человека регистрируют ЭКГ и отслеживают потребление кислорода. Человек бежит по беговой дорожке, а параллельно происходит анализ газообмена. Потом данные сравнивают с состоянием покоя и выводят коэффициент. Если показатель не соответствует норме, это может говорить о перетренированности. А перетренированность — косвенный признак, что митохондрии в плохом состоянии.

Информация полезна тем, кто много и усиленно тренируется. Остальным вряд ли стоит делать тест. Если результат плохой, это может говорить о развитии рака и ряда хронических заболеваний, но для их мониторинга есть и более удобные чекапы.

II. Биохимические тесты

Более точный метод — анализ биохимических маркеров. Помогут следующие тесты.

Но важно помнить: биохимические анализы разработаны для диагностики митохондриальных заболеваний, а не для оценки состояния митохондрий здоровых людей. То же повышение уровня лактата может быть маркером перетренированности, а может говорить о самых разных заболеваниях: от митохондриальной дисфункции до ишемической болезни. Интерпретировать результаты анализов нужно с врачом.

Как помочь митохондриям?

Главная причина нездоровья митохондрий — окислительный стресс, когда активных форм кислорода слишком много. Лекарств для митохондрий пока нет. Но помочь им можно, скорректировав образ жизни. Вот главные интервенции, которые советует биохимик и биохакер Екатерина Щербакова, научный сотрудник ФГБНУ «ЦНИИТ» и автор книги «Питание биохакера».

Ограничить калории

Мы едим, чтобы кормить митохондрии. И для них важно, сколько мы едим. Ограничение калорийности — единственная диета, которая безоговорочно увеличивает продолжительность жизни у лабораторных организмов: от дрожжей и мух до грызунов и обезьян. У них снижается уровень воспаления, а аутофагия, естественный процесс избавления от «клеточного мусора», активируется. В том числе активируется митофагия — аутофагия митохондрий, что позволяет удалять неработающие митохондрии.

Одновременно с этим повышается уровень нейротрофического фактора мозга (BDNF), что способствует формированию новых нейронов и синапсов. В результате ограничение калорий замедляет гибель нейронов у животных с болезнями Хантингтона, Альцгеймера, Паркинсона. А еще — снижает частоту возрастных заболеваний: рака, диабета, болезней сердца.

Почему так? Молекулярных бонусов ограничения калорий несколько. Например, оно приводит к восстановлению одного из главных клеточных антиоксидантов — глутатиона, а также уровня кофермента NAD+, который помогает превращать питательные вещества в энергию. А еще голод активирует сиртуины. Эти белки имеют две функции. Во-первых, выключают гены, использовать которые клетка в режиме голода не должна. Во-вторых, участвуют в устранении повреждений ДНК, в том числе — вызванных активными формами кислорода.

Морить себя голодом ради здоровья митохондрий не нужно. Достаточно урезать суточную калорийность рациона на 25%. Так сделали в одном американском исследовании со здоровыми людьми с лишним весом. Женщины, например, вместо 2200 ккал съедали 1650 ккал — что меньше нормы, но не настолько, чтобы мучиться от голода. Через шесть месяцев у участников эксперимента уменьшилось повреждение митохондриальной ДНК. Митохондрий стало больше, и они стали эффективнее функционировать. Похожие эффекты ученые наблюдают и у мышей при интервальном голодании.

Почему голод помогает митохондриям? С точки зрения организма, клетка в бедственном положении. Она бросает все силы на производство энергии. При этом активируются ферменты антиоксидантной защиты, репарации. В результате увеличивается и количество, и работоспособность митохондрий.

Кормить митохондрии витаминами и антиоксидантами

Просто ограничить калории недостаточно. Митохондрии нуждаются в витаминах, микроэлементах и антиоксидантах.

Подкармливать кишечные бактерии гранатом и орехами

В кишечнике человека живет множество бактерий. Среди них есть союзники, которые помогают иммунной системе распознавать патогены. Эти кишечные бактерии общаются не только с иммунными клетками, но и с митохондриями.

Странно ли это? Вовсе нет, если вспомнить о бактериальном происхождении митохондрий. Общаются митохондрии и бактерии на языке метаболитов. Например, бактерии выделяют короткоцепочечные жирные кислоты, которые нужны митохондриям для синтеза АТФ. Или уролитин А — вещество, которое активирует митофагию — процесс уничтожения дефектных митохондрий, которые уже производят не энергию, а активные формы кислорода.

Уролитин А синтезируют бактерии Eggerthellaceae. Они используют для этого вещества, которые есть во фруктах и ягодах (гранат, малина) и орехах (идеальный вариант — грецкий). А еще для Eggerthellaceae и для других кишечных союзников полезны клетчатка, ферментированная пища, пробиотики и пребиотики.

Больше двигаться

Самый эффективный способ улучшить работу митохондрий — регулярные тренировки: они увеличивают и количество, и качество митохондрий. Так происходит потому, что сокращение мышц — процесс энергозатратный. Сами по себе мышцы не сокращаются. Чтобы их стимулировать, организм использует АТФ. А АТФ синтезируют митохондрии. Потому стоит нам начать двигаться, как клетки адаптируются, чтобы получать больше АТФ: ведь она теперь активнее тратится.

Мышечные клетки ускоряют работу своих митохондрий: синтезируют белки, необходимые для расщепления жирных кислот, — и отправляют их в митохондрии. Митохондрии получают больше белков, расщепляют жиры быстрее, используют больше кислорода и глюкозы — и синтезируют больше АТФ. Параллельно мышечные клетки запускают процесс биогенеза митохондрий. Митохондрий в клетке становится больше — и мы получаем больше АТФ.

Но и это еще не все. Когда мы занимаемся спортом, клетка остро нуждается в АТФ и поднимает планку для митохондрий. Чтобы отсеять плохо работающие органеллы, она активно синтезирует специальные белки, которые проверяют, насколько хорошо те работают. Если белки обнаруживают, что митохондрия работает так себе, клетка ее уничтожает. Иными словами, когда мы активно двигаемся, мы избавляемся от дефектных митохондрий.

Тренироваться разнообразно

Различные типы тренировок воздействуют на различные типы мышечных волокон — и по-разному влияют на митохондрии. Обычно советуют аэробные тренировки: одного упражнения на выносливость уже достаточно, чтобы митохондрии стали работать немного эффективнее. При длительных тренировках объем митохондрий обычно увеличивается на 40–50%, и это происходит параллельно с улучшением работы митохондрий.

Но аэробные тренировки бывают разными — и по-разному влияют на мышцы и митохондрии. Продолжительные кардионагрузки вроде длительного бега, плавания и езды на велосипеде задействуют в первую очередь медленные мышечные волокна и митохондрии в них. Для адаптации митохондрий в красных мышечных и белых мышечных волокнах нужна высокоинтенсивная, но короткая тренировка. Например, интервальная тренировка спринта (SIT) или интервальная тренировка высокой интенсивности (HIIT) — они сочетают и аэробную, и анаэробную нагрузку.

А вот польза чисто анаэробных тренировок для митохондрий — вопрос спорный. Раньше считалось, что силовые тренировки не так хороши, как кардио: они увеличивают объем мышц, но не меняют качество самих мышечных клеток, а значит, не влияют на работу митохондрий. Но появляются новые данные, согласно которым упражнения с отягощениями стимулируют биогенез митохондрий в мышцах и производство митохондриями энергии [1, 2]. Так что самое практичное решение — сочетать разные типы нагрузки: и бегать на длинные дистанции, и делать интервальные тренировки высокой интенсивности, и не забывать про силовые тренировки.

Не забывать отдыхать

Спорт для митохондрий полезен, но не когда его слишком много. Если перестараться, можно повредить мышечные клетки, что приведет к их атрофии и синдрому перетренированности. А еще изнурительные тренировки стимулируют повышенное образование активных форм кислорода, что вредит митохондриям.

Также по теме. Микробиом: как полюбить полчища населяющих нас бактерий. Ссылка.

Источник

Как раскрыть секреты цитохрома с

06 декабря 2015

Как раскрыть секреты цитохрома с

Автор

Редактор

Статья на конкурс «био/мол/текст»: «Только ленивый не занимался митохондриями!» — сказал один профессор. И действительно, митохондрии — очень популярный объект исследования, ведь в них происходит множество сложнейших биохимических и биофизических процессов, обусловливающих широкий набор функций данных органелл. Но, несмотря на активность исследователей, многие механизмы этих процессов и свойства отдельных компонентов митохондрий остаются загадкой. Это связано в первую очередь с отсутствием подходящих неинвазивных методик. В ходе междисциплинарного проекта, проводимого группой биофизики клетки Биологического ф-та МГУ и лабораторией неорганического материаловедения химического ф-та МГУ совместно с коллегами из Германии и Дании, удалось создать методику на основе спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния для селективного исследования цитохрома с непосредственно в живых митохондриях. Статья опубликована в журнале Scientific reports.

Обратите внимание!

Эта работа заняла первое место в номинации «Своя работа» конкурса «био/мол/текст»-2015.

Спонсором номинации «Лучшая статья о механизмах старения и долголетия» является фонд «Наука за продление жизни». Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon.

Спонсоры конкурса: Лаборатория биотехнологических исследований 3D Bioprinting Solutions и Студия научной графики, анимации и моделирования Visual Science.

О, эти спектры! О, эти пики!
В тайны молекул можем мы заглянуть.
Так и работаем мы в этом ЛИКе*,
И не напрасно избрали свой путь!
* — Лаборатория искусственного климата (ЛИК)
— прежнее название корпуса каф. Биофизики биофака МГУ.

Жалюзи опущены. Выключен свет. Мы погружены во мрак. Капля мутной жидкости падает на серебряную подложку. Вспышка зелёного света. 30 секунд. Спектр. Так начинается наш длинный день. А теперь обо всём по порядку.

Эти важные органеллы

Как вы уже (наверное) догадались, капля мутной жидкости — не что иное, как суспензия митохондрий. Митохондрии — это клеточные органеллы* размером около 1 микрона. Основная функция митохондрий — это окисление питательных веществ и производство молекул АТФ — универсального источника энергии для большинства биологических процессов в клетках. Кроме того, митохондрии участвуют в инициации апоптоза, старении клеток, продукции активных форм кислорода (АФК) [1], метаболизме лекарств, выработке тепла, запасают в себе ионы кальция, синтезируют некоторые гормоны и т.д. [2]. Митохондрии обладают столь широким спектром функций, что нарушение их работы является причиной многих заболеваний: различных видов миопатий, сердечно-сосудистых заболеваний, диабета и многих других [3]. Большинство из них связаны с мутациями в генах, кодирующих белки митохондрий**. Но может быть и наоборот: некоторые заболевания или неправильный образ жизни могут привести к нарушению работы митохондрий, например ожирение [4] или употребление наркотиков [5]. С другой стороны, митохондрии как преобразователи энергии и, фактически, белковый электропровод представляют большой интерес для физиков — биоников [6].

* — Органеллами митохондрии стали не сразу: согласно теории симбиогенеза, они появились в эукариотических клетках как бактерии-симбионты. И за миллиарды лет обросли множеством функций [7].

** — Т.к. митохондрии передаются по наследству от матери, то потомство получает все генетические нарушения, которые присутствовали в материнских митохондриях, но в перспективе эту проблему можно будет решить с помощью донорских митохондрий [8].

Митохондрии: как всё устроено

Митохондрии состоят из двух мембран: внешней, проницаемой для ионов и некоторых белков, и внутренней, ограничивающей внутреннее пространство митохондрий — матрикс. Пространство между мембранами так и называется — межмембранное пространство (ММП). Внутренняя мембрана образует множество инвагинаций (так называемых крист). В матриксе митохондрий расположены ферменты цикла Кребса, а во внутренней мембране митохондрий находится четыре белковых комплекса дыхательной цепи (электрон-транспортной цепи, ЭТЦ) и АТФ-синтаза (рис. 1). Также в митохондриях есть подвижные элементы дыхательной цепи: убихинон во внутренней мембране и цитохром с в ММП. Принцип работы дыхательной цепи — окисление субстратов, поступающих из цикла Кребса, и перенос электронов от этих субстратов по кофакторам ЭТЦ на конечный акцептор — кислород. Есть определенная закономерность в последовательности переноса электрона: электроны поступают от донора с более отрицательным редокс-потенциалом* (Е_red/ox) к акцептору с более положительным Е_red/ox. Таким образом, электрон как будто движется вниз по течению (рис. 2). Во время переноса электронов некоторые комплексы дыхательной цепи закачивают протоны из матрикса в ММП, тем самым создавая электрохимический потенциал на внутренней мембране митохондрий, который используется для синтеза АТФ (рис. 1) [2].

* — Окислительно-восстановительный потенциал — синоним редокс-потенциала (от англ. reduction — восстановление, oxidation — окисление).

Рисунок 1. Во внутренней мембране митохондрий локализованы комплексы дыхательной цепи: I — НАДН-дегидрогеназа, II — сукцинат-дегидрогеназа, III — цитохром b–c1-комплекс, или цитохром с-редуктаза, IV — цитохром а–а3, или цитохромоксидаза, и фермент АТФ-синтаза. Q — убихинон, «с» в зелёном кружке — цитохром с. Чёрными стрелками показан транспорт электрона, пунктирной стрелкой — диффузия цитохрома с от комплекса III к IV, зелеными стрелками — перенос протона.

Рисунок 2. Метафорическое изображение среднеточечных редокс-потенциалов различных переносчиков ЭТЦ митохондрий в энергетической шкале (вольт) на фоне реки Тохмайоки в Карелии.

Несмотря на то, что с митохондриями работали корифеи науки, такие как Кребс, Митчелл, Ленинджер, Чанс, Скулачёв и многие другие, благодаря которым мы столько знаем об этих органеллах, всё же многие митохондриальные процессы и свойства переносчиков электронов до сих пор не изучены. Это связано в первую очередь с отсутствием подходящих неинвазивных методик. В этом году нашей лабораторией в сотрудничестве с коллегами из других факультетов МГУ, а также из Дании и Германии, удалось создать методику для селективного исследования конформации гема цитохрома с непосредственно в живых митохондриях [9].

Что такое конформация гема и почему она важна?

Если приглядеться к комплексам дыхательной цепи (рис. 1), то в трёх из них можно увидеть цитохромы — гем-содержащие белки, которые являются кофакторами, участвующими в переносе электронов. А ещё один цитохром диффундирует в ММП. Всего в митохондриях имеется три типа цитохромов: а, b и с. Они очень похожи и отличаются только боковыми радикалами (рис. 3).

Рисунок 3. Гемы цитохромов разных типов. Каждый гем состоит из четырех пятичленных азотосодержащих циклов, связанных между собой. Это т.н. порфирины. Атомы азота координируют атом железа (Fe). Гемы отличаются боковыми группами, и только гем типа с связан с белком ковалентно. Рисунок из [2].

Рисунок 4. а. Расположение гемов цитохромов с и с₁ при переносе электрона. б. Различные конформация гема цитохромов. Рисунки из [12] и [13].

Наиболее интересен в этом отношении цитохром с, так как это единственный мобильный переносчик электронов, курсирующий в ММП (все остальные цитохромы заякорены в комплексах ЭТЦ), поэтому он наиболее подвержен изменениям, которые могут происходить в митохондриях. Помимо этого выход цитохрома с запускает каскад реакций, ведущих к апоптозу, и в этом процессе тоже важен его редокс-потенциал [14].

Возникает вопрос, как понять, в какой конформации и в каком редокс-состоянии находится гем цитохрома с в митохондриях?

Как увидеть конформацию гема и оценить Е_red/ox?

Рисунок 5. Сверху показан гем типа b, который содержится в эритроцитах, снизу — спектр КР эритроцита. Различные группы атомов и соответствующие им пики обозначены одним цветом. Рисунок из [20].

Численно можно определить Е_red/ox с помощью электрохимических методов. Однако для этого нужные комплексы дыхательной цепи изолируют и помещают в совершенно иные условия среды, что может само по себе изменить их свойства. Благодаря таким мощным методам как ЯМР и рентгеноструктурный анализ, мы знаем, в какой конформации находятся белки и кофакторы дыхательной цепи в окисленной и восстановленной форме. Но нас интересует их состояние в максимально естественных условиях, а также соотношение этих состояний при работе дыхательной цепи. Есть несколько неинвазивных методов для определения окислительно-восстановительного состояния цитохромов. Например, абсорбционная спектроскопия. Спектр поглощения митохондрий — это суммарный спектр всех имеющихся цитохромов в митохондриях, а также ФАД. Но из-за того, что все типы цитохромов очень похожи и, соответственно, обладают схожими спектрами поглощения, а их окислительно-восстановительное состояние всё время меняется при нормальной работе дыхательной цепи, становится сложно оценить вклад различных цитохромов в спектр [15].

По спектрам флуоресценции НАДН и ФАД + можно примерно оценить редокс-состояние только комплексов I и II. А по потенциалу на внутренней мембране митохондрий можно судить только о работе митохондрии в целом [16].

Напрямую получение информации о конформации и редокс-состоянии цитохрома с в интактной (целой и функционирующей) митохондрии — это крайне сложная задача, ведь его конформация постоянно меняется при работе ЭТЦ, он диффундирует и взаимодействует с мембранными комплексами. Наличие метода, который бы позволял это сделать, значительно расширило бы наши знания о влиянии цитохрома с на активность дыхательной цепи и его вкладе в развитие митохондриальных патологий.

К митохондриям от чистого сердца

Несколько лет назад в работах нашей группы вопрос о неинвазивном методе исследования цитохромов митохондрий в клетках уже поднимался. На тот момент сотрудники лаборатории исследовали влияние окислительного стресса на кардиомиоциты (клетки сердечной мышцы), методом комбинационного рассеяния света (КР, Raman spectroscopy) [17]. Подробно об этом рассказывается в статье «Спектроскопия КР: новые возможности старого метода» [18].

Спектр комбинационного рассеяния молекулы представляет собой колебательный спектр, пики которого характеризуют нормальные частоты колебаний молекулы. Отдельные группы атомов вносят свой вклад в различные колебания молекулы, поэтому можно сказать, что каждый пик на спектре КР характеризует колебания определённой группы атомов (рис. 5) [19, 20]. Таким образом, спектр КР — нечто вроде «отпечатков пальцев» молекулы. И так же, как по отпечаткам пальцев можно отличить родных братьев, по спектрам КР можно отличить схожие по строению молекулы. Кроме того, спектры КР чувствительны к изменениям конформации молекул, ведь если конформация меняется, то меняются и нормальные частоты колебаний.

В ходе работы с кардиомиоцитами было показано, что спектры КР разных типов цитохромов и миоглобина (который, как и гемоглобин, содержит гем типа b) можно различать по спектрам КР интактных клеток и даже определять их окислительно-восстановительное состояние. Позже Н.А. Браже с другими сотрудниками успешно провели подобное исследование на целом сердце, т.е. in situ (рис. 6) [21].

Рисунок 6. Регистрация спектра КР целого сердца. Рисунок из [21].

Однако у цитохромов есть одна особенность — спектр КР интенсивен только для восстановленных их форм, тогда как спектр окисленных состояний обладает очень низкой интенсивностью. Поэтому основным критерием определения восстановленности цитохромов является интенсивность сигнала. Но если мы ориентируемся только на интенсивность, то можем потерять важную информацию об изменениях в исследуемой системе! Ведь интенсивность зависит и от количества молекул, и от выраженности тех или иных колебаний, и от других параметров. К тому же, для определения точного положения пиков большинство исследователей, имеющих дело с цитохромами, вынуждены искусственно восстанавливать образцы, что заведомо нарушает их нативность.

Отчасти проблему решили японские учёные. Они определили, какие пики на спектре КР характерны только для восстановленных, а какие — только для окисленных цитохромов [22]. Однако проблема интенсивности спектров по-прежнему сохранялась. Нужно было её решать!

Усиливая сигнал

Один из способов усилить сигнал КР — это поместить исследуемую молекулу вблизи наночастицы благородного металла, например, золота или серебра. Эти металлы обладают свободными поверхностными электронами, а квант коллективных колебаний таких электронов называется плазмон. Если частота падающего света входит в резонанс с частотой колебаний поверхностных электронов металла, то возникает эффект плазмонного резонанса, который приводит к многократному усилению электромагнитного излучения вблизи наночастицы. Этот эффект используют в методе поверхностного плазмонного резонанса (surface plasmon resonance, SPR), в абсорбционной и флуоресцентной спектроскопии [23]. Но нас интересует способ усилить именно сигнал КР. И для этого существует спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния (ГКР, англ. Surface enhanced Raman spectroscopy, SERS)*.

Спектры КР и ГКР цитохрома с хорошо известны [24, 25]. И что самое замечательное, в отличие от спектров КР, спектры ГКР окисленного и восстановленного цитохрома с практически не отличаются по интенсивности. Так почему бы не зарегистрировать спектр ГКР митохондрий?

Идея пришла от О.В. Сосновцевой, профессора Копенгагенского университета, с которой наша лаборатория сотрудничает не первый год. Она даже предложила «подсобить» с митохондриями, так как с ними работали в соседней лаборатории, и они готовы были поделиться.

На тот момент было только две работы по изучению митохондрий методом ГКР и его разновидностью TERS (когда плазмонная частица находится на острие иглы кантилевера атомно-силового микроскопа, и сигнал ГКР регистрируют при сканировании поверхности образца). В первой работе [26] исследователи регистрировали спектр ГКР только от белков и липидов митохондрий, но не от цитохромов. А во второй работе [27] использовали не нативные, а высушенные митохондрии. Но как применить метод ГКР для изучения цитохромов живых митохондрий? Прежде чем ответить на этот вопрос, следует слегка переместиться в прошлое.

Междисциплинарность — залог успеха

В 2010 году, когда интерес к нанотехнологиям был на высоте, академик Юрий Дмитриевич Третьяков, в то время декан факультета наук о материалах (ФНМ) МГУ, решил начать межфакультетское сотрудничество с биологами для проведения совместных исследований методом ГКР. В итоге сотрудничество было установлено с лабораторией биофизики клетки под руководством Г.В. Максимова. Так наша лаборатория познакомилась с заместителем декана ФНМ химиком-материаловедом член-корр. Е.А. Гудилиным. Совместно с группой Гудилина начались активные исследования по применению ГКР в биологии.

Дело в том, что ГКР — метод непростой и требует исключительно междисциплинарного подхода. Каждый биообъект уникален, и чтобы регистрировать от него сигнал ГКР, нужно разрабатывать уникальные наноструктуры, которые бы усиливали сигнал от нужного объекта, не повреждали его и выдерживали «атаку» физиологических многокомпонентных буферов.

Большинство работ, связанных с ГКР, предполагают адсорбцию молекул на поверхности наноструктур, пусть даже введённых внутрь клетки [28]. Это связано с тем, что усиление сигнала КР наблюдается только на очень небольшом расстоянии от поверхности металла [29]. Однако такой подход не всегда удовлетворяет запросам биологов. В идеале усиление сигнала должно распространяться на достаточно большое расстояние, чтобы можно было работать с целыми клетками и органеллами, при этом не повреждая их, и желательно не вводить ничего внутрь. Для этой цели нужно разрабатывать специфический дизайн наноструктур и придумывать методы их синтеза, чем и занималась группа под руководством Гудилина.

Наконец, длительные и упорные попытки разработать такие структуры для исследования живых клеток увенчались успехом. В 2012-м году дебютировали наноструктурированные подложки для усиления сигнала от примембранного гемоглобина в интактных эритроцитах [20]. За счёт определённой морфологии наноструктур удалось получить усиление сигнала на расстоянии более 10 нм, т.е. больше толщины мембраны эритроцита.

Раз это удалось сделать для эритроцитов, то можно сделать и для митохондрий!

Долгожданный спектр ГКР митохондрий

Жалюзи опущены. Выключен свет. Комната погружена во мрак. Капля суспензии падает на серебряную подложку. Вспышка зелёного света. 30 секунд. Спектр. Тот самый долгожданный спектр ГКР от изолированных сердечных митохондрий был получен! Оставалось только понять, от каких именно структур в митохондриях исходит сигнал.

С учётом размеров компонентов митохондрий (рис. 7) и того, что усиление наблюдается на расстоянии нескольких нанометров от наноструктур, можно было предположить, что спектр ГКР митохондрий будет преимущественно спектром цитохрома с, так как этот цитохром наиболее близко подходит ко внешней мембране митохондрий и, соответственно, к наноструктурам. В то же время остальные цитохромы закреплены в комплексах внутренней мембраны.

Рисунок 7. Схема эксперимента: изолированные сердечные митохондрии помещают на серебряную наноструктурированную поверхность и облучают зелёным лазером. На рисунке показаны размеры мембраны, межмембранного пространства (ММП) и участков комплексов ЭТЦ. VDAC — потенциал зависимый анионный канал, FCCP — протонофор, разобщающий электронный транспорт и синтез АТФ, олигомицин — ингибитор АТФ-синтазы, с в синем кружке — цитохром с. Рисунок из [9].

Это утверждение также подтверждалось при моделировании эффектов усиления КР серебряными наноструктурами, которые были использованы в работе. Группа наших коллег из лазерного центра Ганновера показала, что сложная морфология подложки со множеством углублений, в которые могут попадать митохондрии, позволило получать усиление на большом расстоянии (более 10 нм). А иерархическое устройство самих наноструктур увеличивало число мест контакта с мембраной митохондрий и, следовательно, число молекул цитохрома с, от которых можно было зарегистрировать сигнал ГКР. Если использовать те же наночастицы серебра, просто присоединенные к плоской подложке, то особого усиления не произойдет, что и подтверждалось в эксперименте (рис. 8).

Рисунок 8. а—в — Изображения наноструктур, полученные на сканирующем электронном микроскопе. а — масштаб 10 мкм; б — 1 мкм, в — 0,2 мкм. На изображениях хорошо видна иерархическая морфология серебряных наноструктур. г—д — две модели, которые использовались для математического моделирования эффекта усиления электрического поля наноструктурами. г — в случае, когда митохондрии помещают на плоскую поверхность с наночастицами серебра, не происходит значительного усиления сигнала. д — при использовании структур, образующих полости, покрытые наночастицами серебра, число мест контакта между митохондрией и наночастицами увеличивается, а усиление электрического поля направлено перпендикулярно поверхности, т.е. внутрь митохондрии. За счёт этого достигается многократное усиление сигнала ГКР цитохрома с. Рисунок из [9] с изменениями.

И действительно, полученный спектр ГКР митохондрий соответствовал спектрам цитохрома с! При использовании зелёного лазера в качестве возбуждающего света можно регистрировать сигнал только от цитохромов b и с, но не от цитохрома а, что облегчает задачу расшифровки спектров. Несмотря на схожесть структуры цитохромов типа b и с, они имеют ключевые пики на спектре, благодаря которым их нельзя перепутать (рис. 9). Таким образом, используемые наноструктуры давали усиление на достаточно большом расстоянии, чтобы зарегистрировать спектры от цитохрома с, но недостаточно большом, для того чтобы увидеть пики цитохромов b. И это как раз то, что нужно! Благодаря методу ГКР теперь можно исследовать селективно редокс-состояние и конформацию именно цитохрома с в живых функционирующих митохондриях.

Рисунок 9. а — Спектры ГКР интактных митохондрий, помещенных на серебряную наноструктурированную поверхность. 1 — Спектр искусственно восстановленных цитохромов митохондрий; 2 — спектр активно функционирующих интактных митохондрий. б — Для сравнения приведен спектр ГКР эритроцитов, который соответствует спектру гема типа b, и спектр окисленного изолированного цитохрома с. Красным цветом отмечены пики, по которым можно чётко отличить спектр гема b и с. Рисунок из [9] с изменениями.

Как и ожидалось, спектры ГКР цитохрома с митохондрий оказались очень чувствительны к изменению его окислительно-восстановительного состояния. Для этого было исследовано два воздействия: внесение протонофора FCCP и ингибитора АТФ-синтазы олигомицина.

FCCP встраивается во внутреннюю мембрану митохондрий и начинает переносить протоны из ММП в матрикс, минуя протонные каналы АТФ-синтазы. В результате этого исчезает электрохимический потенциал и прекращается синтез АТФ. Это явление называют разобщением дыхания и фосфорилирования. В результате разобщения количество АТФ снижается, а АДФ увеличивается [30]. В этом случае возрастает количество поглощённого кислорода и скорость окисления субстратов, а, следовательно, и количество окисленных молекул цитохрома с, что очень хорошо видно на спектрах ГКР. И наоборот, добавление ингибитора синтеза АТФ — олигомицина, который приводит к увеличению электрохимического градиента на фоне снижения скорости дыхания, увеличивает количество восстановленных молекул цитохрома с, что также выражено на спектрах ГКР митохондрий.

Таким образом, спектры ГКР митохондрий, являясь спектрами исключительно цитохрома с, оказались чувствительны к изменениям его конформации и редокс-состояния в процессе работы митохондрий.

Схема всей работы в одном ролике

Итоги

Спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния позволяет многократно усилить сигнал КР от молекул вблизи наночастиц металла. Однако для проведения успешных экспериментов необходимо учитывать свойства как биологического объекта, так и наноструктур. «Ключевым моментом нашего достижения стал междисциплинарный подход к работе, в которую были вовлечены биологи, химики и физики», — поясняет одна из главных авторов проекта к.б.н. Надежда Браже, ставшая осенью 2015 года лауреатом премии L’Oreal Unesco для женщин в науке. — «Результатом такого подхода стало создание уникальной методики селективного определения редокс-состояния и конформации цитохрома с в живых функционирующих митохондриях, помещенных на специальную наноструктурированную поверхность. Разработанная методика поможет восполнить пробелы наших знаний о свойствах и поведении переносчиков электрона в митохондриях, а также может быть использована для разработки диагностических тестов для раннего выявления патологий митохондрий, чем и планируется заниматься в ближайшее время».

Источник

Молодость в энергии

Старение митохондрий — один из ключевых компонентов старения организмов. Изучить этот процесс — значит оказаться на шаг ближе к преодолению возрастных заболеваний!

Авторы

Редакторы

Статья на конкурс «Био/Мол/Текст»: В 1973 году Феодосий Добжанский опубликовал работу, в которой прозвучала ставшая крылатой фраза: «Ничто в изучении биологии не имеет смысла кроме как в свете эволюции». Немного перефразируя Добжанского, можно с большой долей уверенности сказать: «ничто в изучении долголетия не имеет смысла, кроме как в свете митохондриальной медицины». Действительно, состояние митохондрий очень хорошо отражает общее состояние организма. Давайте же поговорим о том, какие болезни могут возникнуть в результате нарушения работы митохондрий, как их можно исправить и зачем это нужно.

Конкурс «Био/Мол/Текст»-2020/2021

Эта работа опубликована в номинации «Свободная тема» конкурса «Био/Мол/Текст»-2020/2021.

Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.

Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.

Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

О митохондриях и их функциях

Нет такой возрастной патологии, в которой бы не играла ключевую роль митохондриальная дисфункция. Если ваши митохондрии нормально обновляются и не продуцируют излишне много активных форм кислорода (АФК) — значит, скорее всего, вы молоды, здоровы и счастливы.

Когда-то давно, много тысяч лет назад, человек приручил диких предков собак, сделав их своими помощниками и защитниками. Что-то похожее, только на микроуровне, случилось в процессе эволюции более миллиарда лет назад. Дело в том, что эукариотические клетки возникли в процессе объединения двух более простых клеток: крошечных альфа-протеобактерий, которые стали митохондриями, и архей (локиархей, согласно некоторым данным) [1–3]. Что заставило эти два организма слиться в симбиозе, пока не до конца ясно. Вероятно, они обменивались друг с другом метаболитами, отчего оба получали выгоду. И лишь потом главной функцией митохондрий стал синтез энергии в виде АТФ. Ученые и сейчас расходятся во мнении, было ли изначально это сожительство взаимовыгодным, или же предки митохондрий попали «в рабство». Как бы то ни было, этот симбиоз позволил клетке эукариот подняться на новый энергетический уровень, сделав возможным появление многоклеточных организмов во всем их нынешнем многообразии [4], [5]. Так что же такое митохондрии? Еще в школе мы учили, что клетку можно представить, как целое государство, а митохондрии в ней — «энергетические станции», которые обеспечивают запасание энергии в виде АТФ [6]. Сейчас наше понимание роли митохондрий существенно расширилось.

Сегодня ученые утверждают (и у нас нет повода им не доверять), что митохондрии — это биоэнергетический, биосинтетический и сигнальный центр клетки. Если обобщить, то вот какие функции они выполняют:

Рисунок 1. Строение митохондрии. Помимо собственной ДНК, в митохондриях есть две мембраны — внешняя и внутренняя. Внутренняя мембрана образует выросты — кристы, — и именно на ней расположена дыхательная цепь, которая обеспечивает запасание энергии в виде молекулы АТФ.

Энергии не занимать!

Из курса физики мы знаем, что ток — это направленный поток электронов. Дыхательная цепь митохондрий представляет собой цепь переноса электронов (рис. 2). Только вместо проводов во внутренней мембране расположена целая система трансмембранных белков (комплексов дыхательной цепи) и специальных переносчиков электронов, которые обеспечивают их направленный поток. Представить этот процесс можно в виде передачи пожарными друг другу ведер с водой. При этом комплексы и переносчики расположены таким хитрым образом, что при переходе электрона от одного к другому происходит выделение энергии в цепи окислительно-восстановительных процессов. Примерно, как если бы ведро с водой пожарные передавали своим товарищам, стоящим ниже на ступеньках (согласитесь, это гораздо легче, чем передавать его вышестоящим). Во внутренней мембране одной митохондрии находятся десятки тысяч полных дыхательных цепей.

Рисунок 2. Дыхательная цепь митохондрий. Всего различают четыре комплекса дыхательной цепи, имеющих довольно сложные названия: НАДН-дегидрогеназа (I), сукцинатдегидрогеназа (II), цитохром-С-оксидоредуктаза (III) и цитохром-С-оксидаза (IV). Электрон передается от комплекса I или II к комплексу III, а от него — к комплексу IV. Передача электрона происходит при помощи специальных переносчиков, самым известным из которых это кофермент Q.

Откуда берется электрон, который «путешествует» по цепи переносчиков внутренней мембраны митохондрий? А берется он из водорода. Если помните, водород — очень простой атом. Он состоит всего из одного протона и одного электрона. Водород мы получаем из молекул, которые потребляем с пищей. Будь то жирные кислоты или глюкоза — в конечном счете, после ряда биохимических процессов и превращений, специальный переносчик (НАДН или ФАДН₂) доставляет к дыхательной цепи заветный атом водорода, который даст протон Н + и электрон.

Куда девается электрон, прошедший по цепи? Конечный его акцептор — кислород. Именно поэтому наше дыхание — кислородное. К слову сказать, есть и другие способы дыхания (например бескислородные). Тогда электрон переносится не на кислород, а на другой акцептор [7].

Казалось бы, всё просто? Так куда же девается протон (Н + ), когда электрон отправляется в путешествие по цепи переносчиков? Этот вопрос долго не беспокоил ученых.

Длительное время после открытия комплексов дыхательной цепи тайна дыхания казалась разгаданной. Химия тогда была в большом почете, окислительно-восстановительные реакции активно изучались. Только одно оставалось неясным — переносчик электрона к АТФ-синтазе так и не был обнаружен. И только хемиосмотическая теория, предложенная Питером Митчеллом, пролила свет на тайну дыхания и показала, что такого переносчика просто не существует, а в образовании энергии ключевую роль играет не химия ферментов, а физика мембран.

АТФ-синтаза — еще один компонент внутренней мембраны митохондрий. Это настоящий наномоторчик, который на фотографиях электронного микроскопа и на молекулярных моделях (рис. 3) напоминает гриб. Именно в результате работы АТФ-синтазы образуются молекулы АТФ. Как же это происходит? Та энергия, которая образовалась в окислительно-восстановительных реакциях переноса электронов, идет вовсе не на синтез АТФ, а на «выкачивание» протонов Н + в пространство между двумя мембранами митохондрий. Когда их там оказывается достаточно, мембрана становится заряженной, как аккумулятор. То есть на внутренней мембране митохондрии возникает электрохимический градиент (он же — мембранный потенциал). Вернуться внутрь митохондрии протоны могут только через АТФ-синтазу (видео 1).

Рисунок 3а. Строение АТФ-синтазы. АТФ-синтаза представляет собой комплекс ферментов, объединенных в несколько субъединиц.

Рисунок 3б. Кристаллографическая модель Ca-АТФ-синтазы

Видео 1. Работа электрон-транспортной цепи и АТФ-синтазы. Представьте себе, как вода, падая с высоты, вращает колесо гидротурбины. Нечто похожее происходит и тут: протоны «вращают» ротор АТФ-синтазы. У людей для каждого полного оборота головки нужны девять протонов; при этом образуются три молекулы АТФ.

Неспаренный электрон — это всегда неспокойно. Он постоянно находится в поисках пары, поэтому пытается ее отобрать у других молекул, приводя к образованию всё новых свободных радикалов, которые могут повреждать макромолекулы (ДНК, липиды, белки).

Вам письмо!

Хотя митохондрии называют полуавтономными органеллами, в их ДНК закодировано всего 13 белков. Поэтому они должны обмениваться с ядром сигналами, говорящими об их потребностях и влияющими на активность генов. Ретроградный сигналинг, который мы уже упоминали, активно изучают, ведь его нарушение приводит к поломкам митохондрий и последующему старению или гибели клетки.

На каком же языке «разговаривают» митохондрии? Существует несколько путей коммуникации митохондрий с ядром. Мы приведем лишь некоторые из них:

Помимо коммуникации с ядром у митохондрий есть и другие сигнальные функции. Например, антивирусный сигналинг. При этом митохондрии выступают в роли «датчика вторжения» при попадании вируса в клетку [16]. Но об этом мы поговорим дальше.

Синтезировали-синтезировали.

Помимо синтеза АТФ, в митохондриях происходит еще много всего интересного. Метаболиты цикла Кребса, протекающего в митохондриях, являются предшественниками биосинтеза многих макромолекул, включая липиды, углеводы, белки и нуклеотиды. Митохондрии также участвуют в образовании белков, содержащих гемовые и порфириновые мотивы, и еще в начальных этапах синтеза стероидных гормонов [11], [17].

Эффектное самоубийство

Вероятно на этапах становления симбиоза, если что-то начинало идти не так, митохондрии могли покинуть клетку-хозяина, попросту убив ее. Учитывая тот факт, что у всех многоклеточных организмов митохондрии участвуют в апоптозе, в это нетрудно поверить [18].

Апоптоз — процесс программируемой клеточной гибели [19]. Исходно вызванная предками митохондрий гибель клетки хозяина, вероятно, более напоминала паразитизм и уж никак не приносила одноклеточному хозяину пользу. Но для поддержания нормальной физиологии многоклеточного организма апоптоз просто необходим. Он играет важную роль в развитии и функционировании иммунной системы, гомеостазе и дифференцировке клеток. Его нарушение приводит к онкологическим и нейродегенеративным заболеваниям. У позвоночных апоптоз начинается с изменения проницаемости внешней мембраны митохондрий и высвобождения цитохрома С, активирующего ферменты каспазы. Каспазы же запускают сложную машину программируемой клеточной гибели. К увеличению проницаемости мембраны митохондрий могут приводить как повреждения внутри самой митохондрии, так и вне нее [16].

Подспорье на баррикадах иммунной борьбы

Кроме производства энергии и функций, которые мы уже обсудили, митохондрии исполняют роль «цепного пса» иммунитета — помогают клеткам противостоять атакам бактерий, вирусов и грибов. Кроме этого, митохондрии следят «за порядком в доме». При нахождении клеточных повреждений митохондрии активируют врожденные иммунные реакции, в том числе воспаление. Так организм защищается от внешней и внутренней опасности, реагируя на нарушение гомеостаза.

При травмах, повреждении тканей и гибели клеток в кровь попадают схожие с PAMP молекулярные фрагменты, которые также запускают иммунный ответ. Они носят название DAMP (damage associated molecular patterns) — например, фибриноген, гистоны или мтДНК.

Атака на вирусы

Однако кроме мембранных и цитоплазматических рецепторов в клетке есть еще активные игроки иммунной защиты — митохондрии. На их внешней мембране локализован белок MAVS (mitochondrial antiviral signaling), работающий «датчиком вторжения» патогена и реагирующий на чужеродный наследственный материал — ДНК и РНК вирусов (рис. 4) [16], [22]. Интересно, что некоторые вирусы (например, гепатитов A, B и C) приспособились «атаковать» MAVS при помощи ферментов — протеаз [23].

Рисунок 4. Механизм действия белка MAVS. Распознав патоген, MAVS меняет конформацию и запускает сигнальный каскад, стимулирующий производство интерферонов типа I и других провоспалительных цитокинов для предотвращения репликации вирусов.

Роль митохондрий в противовирусной защите этим не ограничивается. Многие вирусы, попадая в клетку, воздействуют на митохондрии и их динамику (в норме митохондрии всё время делятся и сливаются) и приводят к дисфункции этих органелл (рис. 5). Есть разные мнения насчет того, делают ли они это в своих «корыстных» целях, или же это происходит по выработанному эволюцией механизму, поскольку нередко для вирусов такая стратегия оказывается губительной.

Рисунок 5. Воздействие вирусов на митохондрии при вторжении в клетку. Вирус SARS-CoV имеет фактор вирулентности ORF-9b, который приводит к деградации DRP1 (белка, который отвечает за фрагментацию митохондрий) и к гиперслиянию митохондрий. Белок ВИЧ gp120 также вызывает снижение уровня DRP1. Вирус лихорадки Денге фактически растворяет митохондриальную мембрану. Вирусные белки вначале колонизируют мембрану эндоплазматического ретикулума, формируя каркас, необходимый для репликации РНК вируса, а затем вступают в контакт с находящейся рядом мембраной митохондрий и делают в ней «дырку». Это ведет к нарушению нормальной работы митохондрий, повышению уровня АФК, дальнейшему повреждению мембраны митохондрий и утечке мтДНК в цитоплазму.

Почему же такая стратегия часто вредит вирусам? Она вызывает утечку мтДНК в цитоплазму. Это, с одной стороны, приводит к митохондриальной дисфункции, но с другой — стимулирует противовирусный иммунитет (рис. 6).

Рисунок 6. Механизмы, активируемые при разрушении митохондрий. Разрушение митохондрий вызывает выход мтДНК в цитоплазму и запускает иммунный ответ через путь cGAS-STING. Это компонент врожденной иммунной системы, который позволяет обнаружить ДНК в цитоплазме и в ответ запускает экспрессию провоспалительных генов. ДНК распознается особым белком — циклической ГМФ-АМФ синтазой (cGAS), которая запускает превращение ГМФ и АМФ в 2′3′-цГАМФ. Он, в свою очередь, связывается со стимулятором генов интерферонов (stimulator of interferon genes, STING) и активирует каскад фосфорилирования транскрипционных факторов, что приводит к синтезу интерферонов I типа.

Таким образом, митохондрии, как истинные «охранные псы», включают клеточную сигнализацию, жертвуя собой.

И бактерии тоже победим!

Митохондрии реагируют на вторжение в клетку не только вирусов. Они, некогда сами будучи бактериями, могут противостоять вторжению своих «диких сородичей».

Митохондрии участвуют в таком необычном способе защиты от патогенов, как «внеклеточные ловушки». Этот механизм был открыт в 2004 году учеными Института инфекционной биологии имени Макса Планка (Берлин, Германия) (рис. 7а). Кроме того, мтДНК играет важную роль в «системе оповещения» о внедрении патогена. Как уже было сказано выше, она представляет собой один из DAMP и связывается с рецептором TLR9 внутри клетки. Воздействие патогена стимулирует выделение внеклеточных везикул с мтДНК (рис. 7б), в результате чего активируются антибактериальные и провоспалительные сигнальные пути.

Рисунок 7а. При вторжении патогена нейтрофилы могут выбрасывать ДНК (ядерную и митохондриальную), которая формирует во внеклеточном пространстве сетеподобные структуры — нейтрофильные внеклеточные ловушки. Такая «ловушка» служит каркасом для антимикробных медиаторов, таких как белки гранул иммунных клеток, и участвует в процессах врожденного иммунитета [25–27].

Рисунок 7б. мтДНК, заключенная в везикулы, или даже целые митохондрии, попадает в соседние клетки, передавая таким образом сигнал о вторжении патогена в организм

Интересным способом противостоят митохондрии вторжению токсоплазмы — паразитического внутриклеточного простейшего. Токсоплазма при попадании в клетку запускает липофагию — аутофагию липидных капель, в результате которой ликвидируются жирные кислоты. Чтобы перекрыть токсоплазме доступ к жирным кислотам, митохондрии сливаются друг с другом, «захватывая» липиды и окисляя их [28].

Повреждение митохондрий при вторжении патогенов, сопровождающееся выделением мтДНК и увеличением производства АФК, — мощный стимулятор воспаления. Но совсем иначе складывается ситуация, когда врожденный иммунитет стимулируют не вторгшиеся патогены, а клеточный «мусор». Тогда аномальное накопление поврежденных митохондрий и высвобождение мтДНК в цитозоль становятся причиной различных воспалительных заболеваний и усиления хронического возрастного воспаления. Об этом мы и поговорим далее.

Воспаление и митохондрии

Мы уже упоминали, что помимо компонентов вирусов и бактерий воспаление могут запускать молекулярные фрагменты собственных клеток.

Необходимо помнить, что компоненты митохондрий являются достаточно мощными DAMPs. Ученые полагают, что это связано с бактериальным прошлым митохондрий. Пока митохондрии здоровы и находятся внутри клетки, окруженные двойной мембраной, они не привлекают к себе никакого внимания иммунитета. Но как только мембрана митохондрий повреждается, а мтДНК выходит из митохондрии, запускается воспалительная реакция. Какие же компоненты митохондрий относятся к DAMP?

Роль митохондрий в запуске воспаления не ограничивается тем, что врожденный иммунитет воспринимает их компоненты как DAMPs. Важно помнить, что мтДНК и кардиолипин приводят к активации сборки инфламмасомы (рис. 8).

Рисунок 8. Активация инфламмасомы. NLRP3-инфламмасома обнаруживает микробные вещества и стимулирует «стерильное воспаление», возникающее без воздействия внешних факторов. При отсутствии угрозы в клетке инфламмасома находится в «разобранном состоянии». Молекулярный путь ее активации проходит в два этапа — активация (осуществляется нашими знакомыми сигналами PAMP или DAMP) и сборка. Инфламмасома запускает превращение прокаспазы-1 в каспазу-1 (протеолитический фермент, играющий важнейшую роль в воспалении) и последующую секрецию провоспалительных цитокинов IL-1β и IL-18. После активации IL-1β способствует проникновению иммунных клеток в инфицированные или поврежденные ткани, а IL-18 необходим для выработки интерферона-гамма, который стимулирует клетки иммунной системы. Также каспаза-1 запускает пироптоз. Для этого она расщепляет «белок смерти» газдермин D. Активированный газдермин D перфорирует клеточную мембрану, клетка разбухает и гибнет. Дестабилизация митохондрий, высвобождение мтДНК и кардиолипина являются важными факторами активации инфламмасомы.

К сожалению, повреждение митохондрий происходит не только при вторжении патогенов, когда оно выполняет защитную роль. Митохондрии неизбежно выходят из строя при старении, запуская «стерильное воспаление». Сегодня этот хронический процесс считается общей и одной из главных особенностей старения тканей и причиной большинства возрастных заболеваний [31], [32].

Стареют не только клетки!

Итак, процессы, происходящие в митохондриях, играют важную роль в старении. И если раньше внимание было приковано только к АФК, то сегодня понимание роли митохондрий в старении существенно расширилось (рис. 9) [33].

Рисунок 9. Роль митохондрий в старении клетки и организма

Видео 2. Почему возникают повреждения в митохондриях. Энергетика клеток, биоэнергетическая адаптация клеток и причины их нарушения. Митохондрии — клеточные сенсоры питательных веществ. Здоровая конкуренция субстратов в митохондриях — залог метаболического здоровья. Митохондрии стволовых и сенесцентных клеток, в чем их особенности. Роль митохондрий в стерильном воспалении и аутоиммунитете. Как связано старение организма и работа митохондрий.

С каждым годом к уже описанным процессам прибавляются всё новые и новые, что расширяет наше понимание ситуации. С возрастом происходят следующие изменения, затрагивающие митохондрии [34–36]:

Отчего же возникает митохондриальная дисфункция?

Повреждения мтДНК называли одной из главных причин старения еще со времен господства свободнорадикальной теории старения Хармана. Правда тогда считали, что главная и единственная причина возникновения мутаций — свободные радикалы. В ходе клеточного дыхания митохондриям всё время приходится иметь дело с АФК. Логично предположить, что такая вредная работа со временем приводит к мутациям в мтДНК — резервы истощаются. Сейчас накоплены данные, что существенная часть мутаций мтДНК вызвана ошибками репликации, а не окислительными повреждениями [37]. Как бы то ни было, частота мутаций мтДНК увеличивается с возрастом как у животных, так и у человека. При этом количество копий мтДНК, несущих мутацию, и вид мутаций различаются между тканями и внутри них. Количество мутаций мтДНК растет с возрастом в мозге, сердце, толстом кишечнике, скелетной мускулатуре. Возникают они и в стволовых клетках.

Существует предположение, что повышенное количество мутаций мтДНК влияет на старение и возрастные заболевания. Возражения скептиков сводятся к тому, что вряд ли они достигают такого уровня, чтобы ускорять старение, потому что мтДНК существует в сотнях тысяч копий на клетку. Для того чтобы клетка по-настоящему начала страдать от митохондриальной дисфункции, количество «поломанных» митохондрий должно преодолеть некую «пороговую черту» — около 60% всех митохондрий клетки должны стать нерабочими. Но любая ткань состоит из множества клеток! Сколько же митохондрий должно сломаться, чтобы действительно толкнуть процессы старения?

У сторонников же важной роли поломок мтДНК есть свой аргумент. Генетически модифицированные мыши с дефектной митохондриальной ДНК-полимеразой POLGγ имели сниженное количество копий мтДНК и накапливали ее мутантную форму. И одновременно развивали ускоренный фенотип старения! У них наблюдалось раннее облысение и морщинистость кожи. При этом, если у мышей восстанавливали нормальную работу фермента, то «старческий» фенотип обращался вспять, и мышь снова начинала выглядеть как молодая [38]. Неожиданное объяснение этому явлению было предложено в работе 2019 года А. Суомалайнен. Оказывается, митохондрии, испытывая «дефицит» копий своей ДНК, могут попросту «воровать» нуклеотиды, предназначенные для ядерной ДНК. При этом в мтДНК возникают повреждения, так как нарушаются процессы ее починки [39].

Кроме этого, старение сопровождается нарушением процесса «контроля качества» митохондрий (mitochondrial quality control, MQC). MQC контролирует процессы упаковки и деградации белка, биогенез митохондрий, их динамику и митофагию. Нарушение этих процессов при старении приводит к накоплению поврежденных митохондрий, высвобождению DAMP, окислительному стрессу и стерильному воспалению [40].

Можно ли вылечить митохондрии?

Термин «митохондриальная медицина» изначально возник в связи с исследованиями наследственных митохондриальных заболеваний. Сейчас это понятие расширилось и на возрастную дисфункцию митохондрий.

Митохондриальная медицина развивается!

А сейчас мы попробуем структурировать основные подходы митохондриальной медицины:

Так как процессы, протекающие в митохондриях, взаимосвязаны, данные направления могут пересекаться. Например, стабилизация мембран митохондрий повышает качество процессов митофагии.

Кроме того, направления митохондриальной медицины можно подразделить на:

Видео 3. Понятие митохондриальной медицины. Методы диагностики дисфункции митохондрий. Генетические маркеры дисфункции. Методы консервативного поддержания работы митохондрий: спорт, питание, питательные вещества, антиоксиданты и другие подходы.

А ну-ка все на диагностику!

Качественная и достоверная диагностика митохондриальной дисфункции необходима и для разработки терапий, и для оценки их эффективности. Между тем, в этой области не существует стандартного набора методов. Зато существует ряд трудностей:

Между тем, маркеры для оценки митохондриальной дисфункции существуют, и новые диагностические методики находятся в разработке.

Всех построим в ряд

Все существующие и потенциальные маркеры диагностики митохондриальной дисфункции можно подразделить на биохимические и генетические.

Биохимические маркеры

Эти маркеры косвенно свидетельствует о нарушении работы дыхательной цепи. Группа методик по определению биохимических маркеров описана в руководстве по диагностике митохондриальных заболеваний (определение уровня лактата, пирувата, их соотношения; количественное определение аминокислот, органических кислот и ацилкарнитинов; измерение количества ферментов — креатинкиназы, цитратсинтазы, сукцинатдегидрогеназы, цитрохром-с-оксидазы). Данные методы достаточно удобны, однако обладают невысокой специфичностью [46].

Также к биохимическим относят и более новые подходы: метаболомику, определение количества сывороточных цитокинов и микроРНК. Они используются для оценки вклада митохондриальной дисфункции при диабетической нефропатии [47], болезни Альцгеймера [48], биполярных нарушениях [49], для дифференциальной диагностики при сердечной недостаточности [50].

Что касается цитокинов, то в последние годы было установлено, что сывороточный фактор роста фибробластов 21 (FGF-21) и сывороточный фактор роста и дифференцировки 15 (GDF-15) — два многообещающих диагностических маркера митохондриальных заболеваний. Они более чувствительны и специфичны, чем используемые в клинической практике, но еще не включены в официальные протоколы. Эти факторы лучше использовать для диагностики митохондриальных дефектов трансляции и поддержания мтДНК, чем для патологий дыхательных комплексов или факторов сборки [51].

Генетические маркеры

Это очень важная группа маркеров, так как нарушение генетического аппарата митохондрий — не только следствие, но и причина митохондриальной «поломки». Дисфункция митохондрий сопровождается накоплением в них генетических патологий: как точечных мутаций, так и делеций длинных последовательностей ДНК. Количество генетических нарушений мтДНК растет с возрастом в мозге, сердце, толстом кишечнике, скелетной мускулатуре. Еще более неприятно то, что даже в самых юных клетках нашего организма — стволовых клетках — с возрастом увеличивается количество митохондрий с мутациями [52], [53].

К этой группе методов относят определение:

Количество копий мтДНК в Т-клетках, по всей видимости, связано со старением иммунной системы. Дело в том, что Т-клетки обычно находятся в спящем состоянии, пока им не дадут наводку на тот или иной патоген. Тогда их метаболизм существенно меняется. В том числе, происходит увеличение количества копий мтДНК. Но, как оказалось, у пожилых людей копирование мтДНК после активации Т-клеток происходит в гораздо меньшей степени, чем у молодых. При этом Т-клетки долгожителей сохраняют способность к быстрому увеличению количества копий мтДНК при вторжении патогена. Это было показано в работе, сравнивающей иммунный ответ у молодых и больных/здоровых долгожителей [57].

А еще недавно было обнаружено, что восстановление должного количества копий мтДНК замедляет старение сосудов у мышей. Это было определено по показателям снижения эластичности сонной артерии, скорости пульсовой волны в аорте и содержанию в ней эластина и коллагена [58].

А ну-ка глянем, что там?

К методам визуальной оценки относят как инвазивные методики биопсии с последующей оценкой объемной плотности митохондрий, так и неинвазивные — магнитно-резонансную спектроскопию и позитронно-эмиссионную томографию.

Небольшой укольчик

Биопсия инвазивна и дорогостояща, но она всё еще один из основных методов диагностики митохондриальных нарушений. Чаще всего проводят биопсию скелетных мышц или кожи. При подозрении на заболевание также возможна биопсия печени, миокарда. Взятый образец можно анализировать гистохимическими и иммунологическими методами, оценить количество митохондрий в образце ткани, их интактность. Кроме этого, можно выделить митохондрии и провести функциональную оценку (изучить ультраструктуру и сделать биохимический анализ дыхательной цепи).

Волшебный магнит

Магнитно-резонансная терапия (МРС) — метод исследования химических веществ с использованием явления магнитного резонанса. МРС обычно применяется в качестве инструмента для дифференциальной диагностики поражений головного мозга, но может использоваться и для изучения миопатий. Этот метод позволяет проводить количественную оценку метаболитов тканей в устойчивом состоянии. Для оценки работы митохондрий чаще всего используются спектры 31 P (изотопа фосфора) и 1 H (водорода). 1 H позволяет помечать тканеспецифичные метаболиты, такие как лактат, холин и N-ацетиласпартат, и оценивать их содержание в тканях. В то же время использование 31 P позволяет оценить относительные пропорции метаболитов фосфора и, следовательно, окислительную емкость. 31 P-МРС в скелетных мышцах позволяет идентифицировать ключевые различия в биоэнергетике тканей при различных нейромышечных нарушениях [65].

И позитроны тоже!

В отличие от МРС, которая обеспечивает измерение метаболитов в стабильном состоянии, позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) измеряет метаболический поток, что позволяет изучать метаболические и гемодинамические свойства тканей [66]. Для изучения дисфункции митохондрий используются радиоизотопно-меченные метаболиты 15 O, 2-фтор- 18 F-2-дезокси-D-глюкоза и 11 C-пируват, которые характеризуют тканеспецифичную энергетику. При помощи этого метода наиболее изучены пациенты с MELAS-синдромом — прогрессирующим нейродегенеративным заболеванием, характеризующимся энцефалопатией, лактацидозом и инсультоподобными эпизодами. С помощью этой методики у таких больных изучали ткани сердца, мышц и мозга [51], [68].

Спортивные мероприятия

Метод функциональной диагностики — эргоспирометрия — часто используется спортсменами. Для этого проводят нагрузочный тест (человек крутит педали велотренажера или бежит по беговой дорожке) и анализируют газообмен в состоянии покоя, во время нагрузки и в период восстановления. При этом измеряют потребление кислорода (V_О2), выдыхаемый углекислый газ (V_СО2) и вентиляционные параметры, иногда добавляют биомаркеры в крови, в основном лактат. Нарушения митохондриальной функции снижают аэробный потенциал, что фиксируется эргоспирометрией и лактат-стресс-тестом [69], [70].

Метод может использоваться как для подтверждения дисфункции митохондрий, так и для оценки эффективности терапии. Он неинвазивный, доступный и достаточно чувствительный, хоть и требует специального оборудования и подходит не для всех возрастных групп [71].

Лечение митохондриальных недугов

Консервативная терапия

Физическая активность — наиболее доказанный способ оптимизации митохондриальной функции. Регулярные тренировки в течение целого месяца увеличивают содержание митохондрий в клетках на 30–100%, а их объемную плотность на 40%. Если заниматься полгода, активируется системный биогенез митохондрий, предотвращается истощение пула мтДНК, снижается скорость образования мутаций в мтДНК, увеличивается митохондриальная окислительная емкость, а кристы делаются более «компактно упакованными», за счет чего оптимизируется работа дыхательной цепи митохондрий [72]. Биогенез митохондрий повышает максимальное потребление кислорода, оптимизирует процессы поглощения кислорода для окислительного фосфорилирования и окисления жирных кислот (на единицу потребленного субстрата образуется больше энергии АТФ, которую клетка может использовать). Кроме этого, если окисление жирных кислот происходит частично, то накапливаются промежуточные продукты (церамиды и диацилглицеролы). Сокращение мышцы запускает ряд изменений (повышение уровня внутриклеточного кальция, снижение значения АТФ/АМФ, повышение значения НАД + /НАДH и повышение количества АФК), влияющих на основные внутриклеточные сигнальные пути, которые контролируют работу митохондрий (АМФ-активируемую протеинкиназу, фактор, индуцируемый гипоксией 1-альфа), и на синтез PGC1ɑ — главного регулятора образования митохондрий [73].

При этом как длительные тренировки умеренной интенсивности, так и высокоинтенсивные интервальные тренировки и даже интервальный спринт (который считается типично анаэробной историей и занимает 10 мин в неделю) запускают сходное изменение в уровнях маркеров биогенеза митохондрий: повышение количества цитратсинтазы и цитохром-С-оксидазы. Но только длительные тренировки приводят к росту количества митохондрий, а кратковременные интервальные лишь влияют на эффективность деятельности уже существующих, меняя их ультраструктуру и оптимизируя работу дыхательной цепи [73].

Митохондрии непрерывно находятся в динамике, регулируя поступление или расход энергии. Ведь мы «кормим» свои клетки или слишком много, или слишком мало, а в ответ требуем выдать то количество АТФ, которое точно должно соответствовать нашим потребностям. Чтобы регулярно выходить из этой ситуации, митохондрии и используют своеобразные «движения» — деление и слияние между собой. Эти «митодвижения» объединяют под названием «динамика митохондрий». Баланс между делением и слиянием митохондрий — центральный механизм биоэнергетической адаптации к метаболическим потребностям клетки. Так, если в клетку какой-либо из тканей (кроме некоторых нейронов в мозге) поступает большое количество питательных веществ, и поступление превышает затраты, то митохондрии находятся во фрагментированном состоянии. Если клетка голодает, и поступления меньше затрат, митохондрии сливаются.

В чем смысл этих движений? Если клетка голодает, то слияние митохондрий позволяет увеличить их биоэнергетическую эффективность. Если же еды избыток, то задача митохондрий — рассеять побольше энергии в виде тепла, чтобы избежать окислительного стресса. Фрагментация митохондрий позволяет им снизить биоэнергетическую эффективность и защитить клетку от окислительного стресса. Кроме этого, нормальный цикл деления митохондрий и их слияния — это ключевое звено контроля их качества [74–80].

Что касается витаминов, то для нормальной работы дыхательной цепи необходимо адекватное (а не избыточное!) поступление в организм цинка, магния, витаминов группы В, витаминов С и Е. При построении плана правильного питания это обязательно нужно учитывать.

На работу митохондрий также влияет ряд компонентов, входящих в БАДы (коэнзим Q, карнитин, нитраты, кофеин, альфа-липоевая кислота, таурин, мелатонин). Их эффективность подтверждена далеко не во всех случаях и сильно зависит от возрастной группы и степени дисфункции митохондрий.

Питание также может оказывать свое воздействие на митохондрии через микробиом. Да данный момент расшифровано более трех миллионов генов микробного сообщества — это в 150 раз больше, чем полное число генов в нашем геноме [81]. Микроорганизмы, населяющие наш кишечник, выделяют разнообразные метаболиты, которые влияют на наш организм и, в частности, на митохондрии. Возможно, способность так чутко реагировать на метаболиты микроорганизмов осталась у митохондрий со времен «бактериального прошлого». Взаимодействие микробиом—митохондрии сейчас в топе научных интересов не только с теоретической точки зрения. Используя знания из этой области, можно разработать способ повлиять на наши митохондрии при помощи модификации микробиома. Сделать это вполне реально: в определенных пределах использование тех или иных пищевых компонентов, пре- и пробиотиков может изменить количество микроорганизмов, выделяющих те или иные метаболиты [82–84].

Метаболиты микробиома можно разделить на группы по типу их воздействия на митохондрии:

Может быть, стоит оказать на них влияние?

Значительная часть препаратов — потенциальных геропротекторов — оказывает воздействие на митохондрии. Рассмотрим некоторые из них.

Мишень — кардиолипин

Кардиолипин — фосфолипид, который в норме находится только во внутренней мембране митохондрий и там же синтезируется. Он состоит из четырех ацильных цепочек, которые «удерживаются» глицерином и двумя фосфатными головками (рис. 10).

Рисунок 10. Химическая формула кардиолипина

Жирные кислоты, входящие в состав кардиолипина, различаются от ткани к ткани. В митохондриях мышц и сердца это в основном линолевая кислота. В мозге кардиолипин имеет более разнообразный жирнокислотный состав: он содержит полиненасыщенные жирные кислоты, арахидоновую и докозагексаеновую кислоты. Кардиолипин имеет уникальную коническую форму, которая агрегирует в небислойные структуры и способствует образованию крист митохондрий. Благодаря кардиолипину формируется пространственная структура внутренней мембраны, в которой комплексы дыхательной цепи сильно сближаются, формируя так называемые суперкомплексы. Благодаря этому электроны переходят от комплекса к комплексу быстрее, их утечка и образование АФК снижаются, а скорость синтеза АТФ растет.

Дефицит кардиолипина ведет к нарушению структуры крист и снижению синтеза АТФ. Ведь если связь между комплексами нарушается, и они расположены не оптимальным образом, то образование свободных радикалов усиливается, а синтез АТФ падает.

В кардиолипин входят ненасыщенные жирные кислоты, подверженные окислению. Для митохондрий это плохо, так как полупериод жизни кардиолипина гораздо больше, чем у других фосфолипидов, и он реже обновляется. Старение сопровождается истощением пула кардиолипина и окислительным стрессом [95]. Но самое интересное не то, что кардиолипина становится меньше, а то, что он становится другим. При старении происходит его ремоделирование, линолевой кислоты становится меньше, а полиненасыщенных кислот — больше. Нарушается поток электронов по дыхательной цепи, их утечка растет, повышается выработка свободных радикалов, а энергии образуется меньше. Но еще неприятнее, что ремоделирование кардиолипина нарушает митофагию (рис. 11) [87]. При повреждении митохондрий кардиолипин перераспределяется на внешнюю митохондриальную мембрану и «флажком» маркирует «поломанные» митохондрии, которые быстро удаляются при помощи митофагии. Однако окисление кардиолипина приводит к высвобождению цитохрома С из митохондрий и последующему апоптозу клетки. Вообще следует сказать, что организм плохо воспринимает кардиолипин вне митохондрий, и запускает стерильное воспаление, так как эта молекула очень похожа на фрагмент бактерии.

Рисунок 11. Биологические функции кардиолипина: участие в сборке и функционировании дыхательных суперкомплексов и переносе через них субстрата и электронов; участие в динамике митохондрий; повышение митохондриального биогенеза белков; участие в образовании крист митохондрий. Кроме того, кардиолипин — платформа для интегрирования процессов контроля качества митохондрий.

Неудивительно, что существенная роль кардиолипина в митохондриальных процессах и изменение его структуры с возрастом делают его интересной целью митохондриальной медицины. Подходы тут самые разные.

Например, для терапии могут использоваться фосфолипиды — прекурсоры кардиолипина. Один из них — фосфатидилглицерол. В исследовании in vitro было показано, что фосфатидилглицерол встраивается в мембраны митохондрий, при чем повышается уровень синтеза АТФ и растет потребление кислорода, а также снижается продукция провоспалительных цитокинов [97]. В экспериментах in vivo всё, конечно, намного сложнее, так как возникают вопросы о биодоступности исследовательского материала.

Помимо фосфолипидов-предшественников, есть еще коммерческий фармакологический препарат эламипретид. Он поглощается клетками при помощи пассивной диффузии, проникая даже в деполяризованные митохондрии, и взаимодействует с кардиолипином. In vitro было показано, что эламипретид оказывает на организм следующее воздействие:

У мышей эламипретид повышал выносливость и ремоделировал структуру крист митохондрий в канальцах почек при метаболическом синдроме, в эндотелии сосудов при ишемии, в сетчатке глаза при диабетической ретинопатии. Возможно, он даже способствует сохранению жирнокислотного состава кардиолипина и восстанавливает динамику митохондрий и митофагию [99–101].

Исследований по этому пептиду накоплено уже очень много, и на грызунах он показывает довольно многообещающие результаты. Например, старые мыши бегали почти как молодые после восьми дней терапии этим препаратом, причем положительные изменения начались уже через час после введения [102]! Это говорит об улучшении митохондриальной функции именно за счет защиты кардиолипина от структурных изменений и улучшения качества работы ЭТЦ. Также он повышает когнитивные способности у старых мышей, при этом положительно влияя на эндотелий сосудов головного мозга [103]. У здоровых пожилых людей уже после однократного введения эламипретид улучшал показатели мышц до уровня, сопоставимого чуть ли не с уровнем, которого можно достигнуть в течение полугода тренировок.

Эламипретид сейчас проходит клинические испытания второй фазы (NCT02805790, NCT02693119, NCT02976038). Недавно две компании: Stealth BioTherapeutics (специализация — митохондриальные заболевания) и Alexion Pharmaceuticals (специализация — редкие заболевания) подписали соглашение для совместной разработки и коммерциализации этого препарата.

Скажи «нет» окислению!

Если раньше, согласно теории Хармана, АФК считали главной причиной старения и всевозможных повреждений, то сейчас мы знаем, что это не совсем так.

Сегодня известно, что АФК — это не столько «зло», сколько сигнал к действию. И только когда организм не может отреагировать на этот сигнал должным образом (усилив антиоксидантную защиту, устранив поврежденные митохондрии, обеспечив работающие митохондрии недостающими им белками) — только тогда свободные радикалы становятся орудием массового поражения, что приводит к окислительному стрессу, воспалению и старению. У здоровых людей использование антиоксидантов может снижать показатели адаптации к спортивным нагрузкам. Поэтому их эффективность для улучшения состояния организма в значительной мере зависит от выбранной целевой группы.

Для нейтрализации АФК в организме существуют различные системы антиоксидантной защиты (эндогенные антиоксиданты). Но как бы ни совершенна была наша клеточная система антиоксидантной защиты, иногда ее оказывается недостаточно для предотвращения развития окислительного стресса и воспаления. Тогда возможно использование экзогенных антиоксидантов. Несмотря на то, что свободнорадикальная теория старения была пересмотрена, поиск новых антиоксидантов и оптимизация их работы всё еще находятся в топе биотехнологических исследований в митохондриальной медицине, и антиоксиданты представляют собой наиболее обширную группу препаратов, используемых при терапии дисфункции митохондрий.

Необходимо отметить, что понятие «антиоксиданты» очень широкое. К ним относятся совершенно разные соединения и молекулы, которые способны:

Антиоксиданты могут снижать окислительный стресс, но они не влияют на производство АТФ и работу дыхательной цепи. Они могут действовать как в цитоплазме (например витамин С), так и в липидной фракции мембран (витамин Е). Так как митохондрии в клетке являются основным местом образования АФК, то разрабатываются также таргетные антиоксиданты, действие которых направлено непосредственно на митохондрии.

К группе таргетных антиоксидантов относятся SkQ (ионы Скулачева) и MitoQ. Они могут проходить через двойную мембрану митохондрий, воздействуя непосредственно в месте образования свободных радикалов — вблизи ЭТЦ. Молекула SkQ состоит из двух частей: челнока, который протаскивает ее через мембрану митохондрий, и антиоксиданта пластохинона (растительного аналога убихинона, или коэнзима Q₁₀).

Препарат MitoQ по своему механизму действия очень сходен с SkQ. Молекула митохинона (MitoQ) состоит из переносчика через митохондриальную мембрану и убихинона. Однако оба эти соединения не проникают в деполяризованные митохондрии, так как их способность проходить через митохондриальную мембрану напрямую зависит от ее заряда.

На искусственных моделях старения MitoQ показывает стандартно хорошие результаты. Выяснено, что использование препарата улучшает сосудистую функцию у пожилых людей [104]. Лекарственный препарат с SkQ «Визомитин» (глазные капли) нацелен на различные возрастзависимые офтальмологические проблемы — синдром сухого глаза (3 фаза клинических испытаний), увеиты (2 фаза), сухая макулярная дегенерация (2 фаза). А препарат «Пластомитин» — на рассеянный склероз, острое повреждение почек, синдром Барта, нейродегенеративные заболевания.

Другим интересным классом соединений, которые оказывают антиоксидантное воздействие, являются широко применяемые препараты для сердца. Среди них ингибиторы ренин-ангиотензиновой системы, ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) (эналаприл, рамиприл), а также сартаны (блокаторы рецептора ангиотензина 1 типа) [105].

Ренин-ангиотензиновая система поддерживает в организме водно-солевой баланс, регулируя таким образом артериальное давление, вазоконстрикцию, накопление клетками натрия и выведение из них калия. При ожирении и старении происходит повышение активности системы РААС, чему отводится большая роль в развитии возрастзависимых патологий: росту стерильного воспаления, развитию дисфункции эндотелия, фиброзу, гипертонии, атеросклерозу, возрастному ремоделированию тканей сердца, болезням почек [106].

Главный эффект ангиотензина — сужение сосудов. Так как это влияет на количество кислорода, то логично предположить, что митохондрии как основные потребители кислорода должны как-то реагировать на изменение количества ангиотензина. И правда, недавно обнаружили, что у митохондрий есть два класса рецепторов к ангиотензину — АТ1 и АТ2. При этом в зависимости от того, с каким из рецепторов свяжется ангиотензин, действие его разнится. Активация АТ2 приводит к снижению митохондриального дыхания и повышению концентрации оксида азота. Эти эффекты защищают от окислительного стресса и вызванного им повреждения. А вот активация АТ1, наоборот, приводит к образованию супероксида и окислительному стрессу. Уровень производства «хороших» рецепторов АТ2 существенно выше, а окислительный стресс приводит к дополнительному компенсаторному усилению их активности.

Однако старение влияет на синтез рецепторов ангиотензина. Казалось бы, должен происходить компенсаторный рост выработки «хороших» АТ2 рецепторов, которые бы снижали окислительный стресс. Однако наблюдается прямо противоположная ситуация: производство АТ2 падает при старении, а вот АТ1, приводящих к образованию супероксид-аниона, растет [107]. Поэтому получается «двойной оксидативный удар» — рост активности РААС и синтеза рецепторов АТ2. Именно поэтому ингибиторы АПФ (эналаприл, рамиприл), снижающие образование ангиотензина, и блокаторы рецептора ангиотензина первого типа (сартаны) оказывают антиоксидантное воздействие.

А если подправить гены?

В то время как методы генной терапии мутаций ядерной ДНК развиваются довольно активно (особенно для моногенных заболеваний) [108], [109], с митохондриями всё гораздо сложнее. Дисфункция наступает только тогда, когда количество митохондрий с мутацией преодолевает некоторую пороговую черту. Мы не можем исправить мутацию во всех митохондриях — в клетке их слишком много. Бóльшая часть методов генной терапии направлена на изменение соотношения митохондриальной гетероплазмии (мутантные → нормальные митохондрии). Общие принципы такой терапии изображены на рисунке 12.

Рисунок 12. Принцип действия генной терапии митохондрий: направленное повреждение мутантных копий мтДНК с последующей репликацией здоровых копий

Именно поэтому практически все методы генной терапии митохондрий направлены не на коррекцию мутантных генов, а на прицельную деградацию ДНК в митохондриях с мутацией, что изменяет соотношение гетероплазмии в сторону немутантных. Данное направление генной терапии носит название «антигеномное», или «антирепликативное».

В нем различают несколько методических подходов, которые мы коротко опишем с указанием их основных преимуществ и недостатков.

Использование ДНК-нуклеаз

Механизм действия таков: если в митохондриальном геноме возникает мутация и появляется специфическая нуклеотидная последовательность, то фермент разрезает ДНК, и такая митохондрия с большой вероятностью будет ликвидирована. Подобные опыты проводились на культурах гепатоцитов мыши: использование генной терапии позволяло изменить уровень гетероплазмии за шесть часов. In vivo такой метод проверяли на мышиной модели при помощи внесения аденовирусного вектора. При этом эндонуклеазы рестрикции, кодируемые им, эффективно изменяли уровень гетероплазмии в сторону здоровых митохондрий. Этот метод довольно безопасен — у подопытных мышей не происходило снижения общего уровня мтДНК и не возникало дополнительных проблем со здоровьем [112], [113].

Недостаток этого метода — сложность в поиске той последовательности-мишени, которая будет присутствовать только в мутантных митохондриях, но не в здоровых. Для более чем двухсот мутаций мтДНК, ассоциированных с заболеваниями, только у двух была обнаружена та единственная и неповторимая последовательность ДНК, подходящая в качестве мишени для нуклеаз.

Создание Zn-finger ДНК-связывающихся модулей (mitoZFN)

Инженерные «цинковые пальцы» (zinc finger nucleases, ZFNs) — это химерные ферменты, содержащие две структурные единицы: связывающуюся со строго определенной последовательностью ДНК и расщепяющую ее. Этот метод широко использовался и для редактирования ядерных геномов, но был вытеснен CRISPR-Cas-технологией. А вот для митохондриального геномного редактирования он по-прежнему применяется на клеточных и животных моделях митохондриальных заболеваний.

Рисунок 13. Генная терапия митохондрий при помощи «цинковых пальцев», разрушающих мутантные копии митохондриальной ДНК, снижая гетероплазмию

Такие модули «цинковых пальцев» были созданы для практически всех шестидесяти четырех нуклеотидных комбинаций кодонов. Для удобства распознавания и последующего удаления к такому модулю можно добавить специфический «флажок», облегчающий распознавание нужной последовательности — метильную метку. В данном случае это может делать метилтрансфераза DNMT3. Такой нуклеотид будет гораздо проще распознать. Благодаря этому комбинация (модуль mitoZFN, направленный на какую-то последовательность, плюс генный конструкт со специфической нуклеазой) позволяет таргетно убирать специфические последовательности мтДНК.

Интересно, что синтез нескольких комбинаций специфичных mtZFNs-модулей использовалась также для удаления «частой делеции» 4977-bp (о которой мы говорили выше) на модели цитоплазматических гибридов клеток. Данная делеция ассоциирована с офтальмоплегией и накапливается у всех людей в процессе старения в различных тканях.

Сложность данного метода в том, что большое количество модулей внутрь митохондрии доставить достаточно сложно.

mitoTALENs (transcription activator-like effector nucleases)

Более перспективным средством избирательного воздействия на мтДНК могут быть векторные конструкции на основе химерных нуклеаз, названные TALENs (transcription activator-like effector nucleases) [114]. Роль ДНК-распознающих структур в них играют белковые домены, каждый из которых распознает только один нуклеотид, природный прототип которых — белки некоторых бактерий, паразитирующих на клетках сельскохозяйственных растений [115].

При этом подходе нуклеазы распознают отдельные нуклеотиды и обеспечивают связывание и расщепление нуклеотидной последовательности, если она начинается с тимидина. Этот подход успешно применялся для изменения уровня гетероплазмии, например, в ооцитах мыши [116].

Такой же подход использовался на мышиной модели гетероплазматической митохондриальной мутации. Для этого была создана модель с мутацией митохондриального гена тРНК аланина. Эта мутация приводила к нестабильности этой тРНК и возникновению сердечно-сосудистых патологий у мышей в более старшем возрасте. В этом исследовании TALEN вводили внутримышечно, внутривенно и внутрибрюшинно. При этом в мышцах и сердце уровень мутантной мтДНК существенно снижался, и эффект был стабилен. Молекулярный дефект был успешно исправлен таким лечением [117].

Основной недостаток этого метода — сложность доставки большого количества TALEN внутрь митохондрии, так как вектор может быть слишком большой.

Редактирование генома при помощи системы CRISPR-Cas9

CRISPR-Cas9 — технология редактирования геномов высших организмов, базирующаяся на иммунной системе бактерий [118]. Данная методика, которая получила широкое распространение для редактирования ядерного генома и совершила революцию в этой области [119], всё еще имеет ограничения для редактирования митохондриального генома. Принцип работы «генетических ножниц» CRISPR-Cas9 — направленное разрезание ДНК в избранных участках. Для этого искусственно синтезируют CRISPR-РНК, в которую включают последовательность, выбранную исследователем. Белок Cas9 способен распознать и связаться с такой синтетической СRISPR-РНК (ее называют «гид», или «направляющая РНК») и разрезает соответствующее место в ДНК [120].

Что касается редактирования митохондриального генома, то тут возникают сложности, так как, во-первых, довольно сложно доставить направляющую РНК внутрь митохондрии, что необходимо для нацеливания белка Cas9. Во-вторых, в митохондриях низкий уровень репарационных процессов, отвечающих за восстановление двунитевых разрывов. При редактировании же генома результат работы CRISPR-Cas9 — это починка двухцепочечного разрыва, произведённого Cas9. С низким уровнем репарации этот процесс протекает довольно сложно.

Общий недостаток всей этой группы методов генного редактирования (а по сути — удаления копий мтДНК, несущих мутацию) — возможность снизить общее количество мтДНК ниже функционального порогового уровня. Это усугубляет проблему митохондриальной дисфункции и может привести к апоптозу клетки.

Так как же вылечить митохондрии?

Сегодня используется в основном консервативное лечение митохондриальных заболеваний, которые не помогают, если степень митохондриальной дисфункции высока или если есть врожденные митохондриальные заболевания. Нормальная работа митохондрий нарушается не только при митохондриальных заболеваниях, но также при болезнях Альцгеймера и Паркинсона, диабете, саркопении, инсулин-резистентности и при таких состояниях как инсульт, инфаркт миокарда, а еще в процессе старения организма. При этом известно, что доставка новых митохондрий или восстановление их пула может давать терапевтический эффект.

По словам ученых, новая парадигма митохондриальной терапии основана на доставке «свежих» органелл [121] — как аутологичных (из клеток того же организма), так и гетерологичных (из других организмов). Искусственное внесение в клетку митохондрий может решить главную проблему возрастной митохондриальной дисфункции: увеличить количество «хороших» митохондрий до порогового уровня, необходимого для нормальной работы клетки.

Необходимо заметить, что in vivo передача митохондрий от клетки к клетке — это нормальный и довольно распространенный в организме процесс. Клетки в нашем организме могут обмениваться мтДНК (в составе экзосом, микровезикул, апоптотических телец) и даже передавать другим клеткам целые митохондрии (при помощи микровезикул и туннельных нанотрубочек). Донорами митохондрий могут быть мезенхимальные стволовые клетки, фибробласты, астроциты, активированные тромбоциты и некоторые другие типы клеток [122].

Перенос митохондрий in vivo выполняет целый ряд физиологических функций:

Что касается искусственного переноса митохондрий, тут можно выделить два основных подхода.

Митохондриальная обогащающая терапия

Это «трансплантация» митохондрий (аутологичных или гетерологичных) in vitro с последующим внедрением «обогащенных» клеток обратно в организм (рис. 14) [127].

Рисунок 14. Принцип проведения митохондриальной обогащающей терапии

Терапия обогащения митохондриями ооцитов при бесплодии использовалась довольно широко, при этом для введения в организм-реципиент брали донорские митохондрии [128–130]. В ооцит, полученный от женщины с проблемами зачатия, вводили фрагмент цитоплазмы с митохондриями из клеток молодой женщины без таковых. Результаты были положительные, но в 2005 году FDA (Food and Drug Administration) запретила этот метод, поскольку был недостаточно изучен риск митохондриальной гетероплазмии. Сейчас терапия обогащения митохондриями используется с применением аутологичных митохондрий, полученных из предшественников половых клеток самого пациента (NCT02586298).

Для лечения митохондриальных заболеваний данный подход запатентовала и использует компания Minovia (Израиль). Пока что в исследование вовлечено пять пациентов с синдромом Пирсона.

Трансфер выделенных изолированных митохондрий непосредственно в ткань или системно в кровоток

Большая часть исследований этого метода проводилась на крысах и кроликах. Трансфер митохондрий на животных моделях успешно использовали для лечения ишемии сердца, постинсультных состояний, острого повреждения легких. При этом брали как аутологичные митохондрии, так и митохондрии от других особей и даже видов [131].

Митохондриальная терапия обещает успешные результаты при различных патологиях: ишемии миокарда, болезни Паркинсона, острой печеночной недостаточности [132–134].

Врачи, работающие над митохондриальной терапией, утверждают, что в ближайшее время эта технология может быть внедрена в качестве стандартного терапевтического подхода в случае внезапного массивного повреждения тканевых митохондрий, в частности, в случаях ишемии сердечной мышцы [133–135].

В ходе развитие митохондриальной терапии потребуется решить еще немало вопросов. Например, очень важно оценить влияние системного и локального введения митохондрий на биомаркеры старения в животных моделях. Важно изучить, будет ли нормально реплицироваться ДНК пересаженных митохондрий, будут ли они способны к нормальному делению и другим процессам?

Ну и конечно, остается совершенствовать методологию. Очень нужно стандартизировать процедуры изоляции митохондрий, подобрать оптимальные концентрации для инъекции, тестировать среды, в которых находятся органеллы, и разработать методики оценки качества и целостности митохондрий. А еще важно выбрать оптимальный источник клеток и тканей для получения митохондрий. На данный момент, к сожалению, единого мнения насчет того, какой источник лучше всего, нет.

Заключение

Митохондрии — удивительные механизмы, работающие на благо нашего здоровья. Они придают нам энергию, защищают от патогенов, участвуют в дыхании. Совсем не удивительно, что ученым пришло в голову использовать их в качестве мишени для терапии различных, в том числе возрастных, заболеваний. Ведь болеет митохондрия — нарушаются многие важнейшие процессы в организме.

Митохондриальная медицина развивается стремительно, направлений и идей в ней множество и каждый день их арсенал пополняется. Митохондриальная медицина — это и лечение, и диагностика. Показатели здоровья митохондрий используются для оценки состояния организма с помощью довольно широкого арсенала методов: определение генетических и биохимических маркеров патологий митохондрий, визуальные методики, МРС, ПЭТ, функциональная диагностика. Простора для фантазии не занимать!

Направлений, в которых нужно работать — множество. Это и консервативная терапия, и генное редактирование, и использование антиоксидантов. Действовать надо всем вместе и сообща! Разработки появляются стремительно, и, кто знает, возможно, скоро они приведут нас к успеху в победе над старением?

Источник

• ← Митенки что это
• Миф что это →