Как сделать срез микротомом видео
Правила резания на микротоме
Предпосылкой для получения хороших гистологических срезов служит правильный выбор угла наклона ножа и угла резания.
Резание на микротоме
Для того чтобы срез можно было исследовать в микроскоп, необходимо, чтобы структурные компоненты составляющих его тканей были хорошо различимы в проходящем свете и чтобы срез был защищен от возможного загрязнения и повреждения. Поэтому дальнейшая обработка среза предусматривает его окрашивание, просветление и заключение.
Блок подвергают обрезке, удаляя свободный чистый парафин (т. е. расположенный вне ткани). С боковых сторон блока оставляют лишь в виде площадки с материалом. Если не произвести такого удаления парафина, то срезы будут не гладкими, а морщинистыми (выпуклыми) в середине по той причине, что чистый парафин, остающийся с боков, сокращается во время резки в большей степени по сравнению с парафином, пропитывающим ткань.
Неприятный момент сморщивания срезов можно уменьшить, подвергая блок охлаждению (лед), Т. е. сообщая ему большую твердость.
Подготавливая парафиновый блок к резке при необходимости получения лент надо стремиться придавать ему правильную прямоугольную форму. Парафиновый блок прочно закрепляют в зажиме микротома, расположив параллельно длиннику микротома. Затем, установив необходимый угол резания и правильный угол наклона ножа, его прочно закрепляют винтами зажимами и располагают под блоком. При строго поперечном положение ножа очень плотный объект заставляет вибрировать его, что сопровождается характерным скрипом и образованием поперечных полос на поверхности блока.
После этого, регулируя винтами механизм подачи, блок устанавливают таким образом, чтобы верхняя его плоскость находилась до лезвия ножа на 0,5-1 мм. Когда предварительная подгонка блока к ножу закончена, устанавливают микрометрическую шкалу на получение толстых (25-30 мкм) срезов и движением ножевых салазок начинают подавать блок вверх до получения с него первых полных срезов. Затем производят моделирование блока: срезают скальпелем избыточный парафин, оставляя вокруг залитого объекта слой не более 2-3 мм, и придают блоку прямоугольную форму. После этого устанавливают микрометрическую шкалу на нужную толщину среза и приступают к окончательной резке материала.
Следует помнить, что перемещение ножевых салазок вдоль рельсового пути нужно производить плавно, без излишних усилий. Нельзя надавливать на рукоятку сверху, так как это проводит к вытеснению слоя масла, находящегося между скользящими поверхностями, и опусканию ножа, вследствие чего срезы получаются неравномерными. Движение микротомным ножом в момент прохождения над блоком надо производить быстро.
Так как парафин сильно тупит ножи, то для резки парафиновых блоков лучше применять ножи твердой закалки, с толстым клином.
Толщина парафиновых срезов колеблется от 3-5 до 15 мкм и зависит как от качества заливки материала, так и от ножа.
Нужно следить, чтобы срез не был прижат к ножу, так как при этом, происходит его приклеивание и повреждение. Готовый срез осторожно снимают с ножа влажной кисточкой (в направлении от спинки к лезвию) и переносят в чашку с теплой (350-400С) водой. Помещают срезы на воду обязательно поверхностью, прилежащей к ножу, определить которую можно по характерному блеску (верхняя сторона всегда матовая).
При резке надо следить, чтобы волоски от кисточки не попадали под режущий край ножа, так как это приводит к повреждению лезвия.
Для наклеивания расправленные срезы вылавливают из воды на заранее подготовленное предметное стекло; для этого стекло одним концом опускают в чашку с водой, проводят под срез и подхватывают его, удерживая препаровальной иглой на средней части стекла. Остатки воды вокруг среза тщательно удаляют тряпочкой и проглаживают пальцем через 2-3 слоя сухой и теплой тряпочкой.
Так как парафиновые срезы при наклейке вбирают воду, то во избежание недоразумений при дальнейшей обработке (т. е. окраске) необходимо их тщательно просушить, только после этого приступить к окраске.
Недостаточно высушенные срезы легко отклеиваются во время окраски, а главное, плохо освобождаются от парафина при обработке ксилолом. Критерием хорошо высушенных срезов являются приобретением ими большей прозрачности по сравнению с беловатыми плохо просушенными срезами.
Если приходится торопиться с окраской, то рекомендуется свежеприклеенные и немного подсохшие (в термостате или на воздухе) срезы слегка подогреветь на платформе электроплиты, осторожно доводя парафин до признаков начального оплавления, но не полного расплавления. Такая обработка способствует более прочной фиксации срезов на предметном стекле.
Для того чтобы срезы прочно пристали к предметному стеклу и не отклеились во время окраски, стекла специально обрабатывают с целью обезжиривания. Для этого их основательно моют в горячей мыльной воде или длительно кипятят в 2-3 % содовом растворе, затем хорошо ополаскивают в чистой горячей воде и промывают (несколько часов) в проточной.
Обработанные и промытые в воде предметные стекла протирают льняной тряпкой, держа стекла за края; и хранят в 960 спирте или в смеси спирта эфиром, откуда их по мере надобности вынимают пинцетом и высушивают. На хорошо обезжиренном предметном стекле вода должна растекаться тонким слоем, а не собираться в капли.
Хорошие предметные стекла должны быть из белого стекла и иметь совершенно ровную поверхность, толщина их не должна превышать 1,2 мм.
Перед самой наклейкой срезов высушенные стекла покрывают тонким слоем смеси белка с глицерином.
Приготовление белка с глицерином. Берут свежий яичный белок (без примеси желтка), взбивают вилкой или шпателем до состояния пены и выливают на большой широкопористый фильтр, предварительно смоченный дистиллированной водой. Фильтрация продолжается около 24 часов. К профильтрованному белку прибавляют равный объем глицерина, размешивают и добавляют кусочек тимола для предупреждения загнивания.
Приготовление предметного стекла с белком. На сухое предметное стекло стеклянной палочкой наносят маленькую капельку смеси белка с глицерином и пальцем тщательно размазывают тонким слоем. Руки должны быть предварительно вымыты, а палец, которым производят размазывание смеси, обработан спиртом. Нанесенный на стекло слой белка с глицерином свертывают при небольшом нагревании (50-600) для чего стекло проводят 2-3 раза над горячей электроплиткой. После такой обработки предметное стекло считается готовым и на него можно наклеивать срезы.
Возможные погрешности при изготовлении парафиновых срезов
Для того чтобы получить хорошие гистологические срезы, необходимо уметь своевременно распознать и устранить причину, ухудшающую качество срезов.
2) низкая температура окружающей среды
3) медленное охлаждение парафина при заливке
4) большой угол наклона ножа
1) залить материал в более мягкий парафин после предварительного растапливания блока в термостате
2) дышать на поверхность блока (согревание) перед каждым движением ножа или приспособить эл. плиту рядом с микротомом
3) изменить угол наклона ножа.
б) Залитый материал в процессе резки выпадает из окружающей массы парафина.
1) при переносе кусочка в формочку для заливки произошло его охлаждение.
1) необходимо блок растопить в термостате и залить заново, строго соблюдая правила заливки, после предварительного растапливания материал переносят в промежуточные срезы (для удаления спирта), затем вновь пропитывают и заливают
2) заливка произведена охлажденным парафином
3) недостаточное удаление спирта перед пропитыванием.
1) переутомление материала при проводке и фиксации.
Невозможно. Можно лишь несколько размягчить материал, если на поверхность резания перед каждым движением ножа наносить слой горячего парафина кисточкой (дав ему затем остыть) или дышать на поверхность блока.
г) Срезы закручиваются, прилипают к поверхности ножа, мнутся.
1) малый угол наклона ножа
3) высокая температура окружающей среды.
1) изменить угол наклона
2) залить материал в более твердый парафин и охладить блок путем помещения перед резкой в холодильник (можно также положить на поверхность резание кусочек льда)
3) приклеивание, сморщивание или разрыв срезов, особенно при резке органов, богатых костной, хрящевой или плотной соединительной ткани, могут быть следствием их электризации.
помещать на лезвие (в месте прохождения среза) каплю воды, дышать на лезвие и блок, натирать участок лезвия и прилежащую часть ножа куском твердого парафина.
е) Срезы разрываются или покрыты бороздами.
1) зазубрины на лезвии ножа
2) грязный парафин (плотные соринки царапают срез и портят лезвие);
3) материал плохо декальцинирован.
1) точка и правка ножа или перемещение в ножедержателе
2) перезаливка в чистый парафин
3) устранить нельзя.
ж) Плоскость среза не однородна (беловатая в средней части).
Расплавление блока и проведение материала через промежуточные срезы до абсолютного спирта. После обезвоживания проводят через промежуточную среду, пропитывают и заливают.
Микротом Delta Optical ручной с лезвием
лучший
есть наш обзор
Есть в наличии
Цена: 3’475 * грн
При сумме покупок от 10’000 грн!
Номер Вашего телефона:
Описание и характеристики
Характеристики
Обзор Микротом Delta Optical ручной с лезвием
Для качественного наблюдения структуры образца необходимо сделать срез толщиной не более 50 мкм.
Увы, но без микротома добиться нужного результата практически не возможно. Если Вы планируете серьёзно увлекаться микробиологий, то задумайтесь над приобретением данного устройства.
Разновидностей микротомов большое количество, основная группа которых относится к профессиональным лабораторным устройства и лишь несколько ручных моделей доступны для домашнего хобби. Далее речь пойдёт именно о таких устройствах.
К нам в руки попали два ручных микротома от торговой марки Delta Optical. Давайте детально изучим их конструкцию и оценим возможности. Для большей наглядности сравним анатомические срезы из микротомов со срезами, получаемыми от обычного одноразового скальпеля, который можно купить практически в любой аптеке за1-2$.
Выберите наиболее удачные срезы и перенесите на предметное стекло. Стекло поместите на предметный столик микроскопа и проведите наблюдения. Если срез получился у Вас достаточно тонким, то Вы запросто рассмотрите клеточную структуру растения.
Теперь можно перейти к простому микротому от Delta Optical. Микротом выполнен полностью из пластика. Состоит из прямоугольного основания, соединённого с круглым холдером, удерживающим классическое бритвенное лезвие под пластиковой ручкой
Одной рукой нужно держать микротом, второй рукой подавать материал, а третей поворачивать лезвие. Очень Важно, чтобы установленное лезвие было максимально новым и острым. В противном случае микротом просто раздавливает материал, повреждая его структуру.
Сделайте несколько десятков срезов и переместите их в часовые стекла или в чашку Петри с жидкостью. Далее выбираете удачные варианты и изучаете под микроскопом. Сравните со срезами от скальпеля.
Вы убедитесь, что разницы в срезах нет, а при должной сноровке, скальпелем срезы получаются даже тоньше. Следовательно, в данном случае, можно обойтись обычным скальпелем.
После того, как мы научились пользоваться скальпелем и простым микротомом, можно перейти к более сложному handheld микротому того же бренда. Конструкция устройства очень интересная. Состоит из микровинта, спрятанного внутри корпуса устройства, предметного столика с отверстием оп центру и механизма фиксации биологического материала.
Корпус полностью металлический, поверхность столика стеклянная. Предметный столик вращается на 360 градусов. На не подвижной части микротома, на корпусе по кругу нанесены деления с цифровым обозначением от 0 до 50.
Цифры обозначают микроны. Один полный оборот микротома позволит сделать срез толщиной в 50 мкм. При повороте микротома на 1 деление у Вас получится срез в 1 микрон (0,001 мм). Если изучаемый материал будет достаточно плотным, то у Вас это получиться сделать.
Для изготовления анатомического среза Вам кроме самого образца понадобится специальная оправка. Дело в том, что отверстие в центре предметного столика микротома имеет диаметр в 14 мм, а стебель нашей толстянки диаметром 2-3 мм.
Как зафиксировать биологический материал? Нам понадобиться оправка. Её изготавливают из твёрдых овощей или фруктов, которые имеют малое содержание сока. Идеальным вариантом можно считать обыкновенную морковь.
Микротом
Рис. 1. Санный микротом: 1 — микрометрический винт; 2 — перекидной механизм подачи; 3 — винт, фиксирующий стержень основания объектодержателя; 4 — стержень основания объектодержателя.
Санные микротомы (рис. 1) используют для получения срезов тканей, предварительно заключенных в парафин или целлоидин. Основные части санного микротома: станина, механизм микроподачи, механизм подъема, объектные салазки с зажимом для ткани, суппорт с ножедержателем. Для получения срезов нефиксированной ткани, а также в случаях, когда необходимо изучить объект в короткий промежуток времени, используют замораживающие микротомы (рис.2), снабженные замораживающим столиком, на котором укрепляется исследуемый объект. Столик гибким шлангом соединен с металлическим баллоном, в котором находится жидкая углекислота. Для замораживания тканевых блоков применяют также термоэлектрический охлаждающий столик (ТОС-1) с селеновым выпрямителем: электрический прибор, корпус которого имеет рабочую охлаждающую поверхность и штуцеры для подведения воды и электрического тока.
Рис. 2. Замораживающий микротом.
Микротом следует содержать в чистоте и регулярно смазывать трущиеся поверхности (направляющие станины, резьбовая часть микровинта, направляющая и трущиеся поверхности механизма подъема) вазелиновым маслом. Для приготовления сверхтонких срезов, пригодных для исследования под электронным микроскопом, применяют ультрамикротомы.
Наибольшее распространение в последнее время получили ультрамикротомы, состоящие из стального стержня, на одном конце которого укреплен объект, зажатый в держателе, а другой связан с основанием прибора ленточной пружиной. Стержень свободно перемещается вверх и вниз, что осуществляется посредством электромотора, вал которого связан со стержнем. При опускании стержня объект проходит мимо ножа (стеклянного, алмазного) и срез оказывается на поверхности жидкости ванночки, прикрепленной к ножу. Точность возвращения ножа в исходное положение равна ±10 Å.
Микротом (от греч. mikros — малый и tome — разрезание, отсечение) — прибор для изготовления гистологических срезов. Среди существующих моделей микротомов наиболее распространены санные, радиальные и ротационные (рис. 1—4). Основными частями микротома являются: массивная станина (корпус), подающий механизм с микрометрическим винтом, держатель объекта (или столик) и держатель микротомного ножа.
Рис. 1. Радиальный микротом со столиком для замораживания объекта. 
Рис. 2. Ротационный микротом с лентой для приемки серийных срезов. 
Рис. 3. Санный микротом (общий вид) 
Рис. 4. Схема устройства большого санного микротома с наклонной плоскостью: а — вид сбоку; б — вид сверху; 1 — станина; 2 — шайба с делениями для неавтоматической подачи объекта; 3 — полозья для скольжения объектодержателя; 4 — шпиндель микрометра; 5 — сток для капельной ванны; 6 — капельная ванна; 7 — штанга для полуавтоматической подачи объекта; 8 — держатель объекта; 9 — держатель ножа; 10 — нож; 11 — блок ножа; 12 — полозья для скольжения блока.
Держатель объекта снабжается винтами, позволяющими закрепить блок в нужном положении по отношению к плоскости движения ножа. Микрометрический винт подающего механизма в большинстве современных моделей устанавливается в наклонной плоскости, но выпускаются и модели с вертикальным расположением винта.
В радиальных микротомах (рис. 1) держатель ножа закреплен у одного из его концов и регулировке поддается лишь угол наклона ножа. Подающий механизм с вертикальной установкой микрометрического винта включается, как и в санных микротомах, при отведении ручки от себя. Микротомы этих двух типов обычно имеют устройство, позволяющее заменять держатель объекта для залитых в парафин или целлоидин кусочков специальным столиком для получения замороженных жидким углекислым газом срезов. Радиальные микротомы не всегда позволяют получить достаточно тонкие срезы из залитого в парафин и особенно в целлоидин материала. Чаще эти микротомы применяют для получения замороженных срезов; нередко их называют «замораживающими микротомами».
Названные типы микротомов позволяют получать срезы не тоньше 1 мк (обычно 5—15 мк). Для получения более тонких срезов, например для работы с электронным микроскопом, служат ультратомы и ультрамикротомы (см.).